一 : 6细胞工程
第六章 核移植技术与动物克隆
一、什么是动物克隆？ 什么是动物克隆？
动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的 技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体 细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中 之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚 胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中， 可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的 经过核移植而产生的 动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。 动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。这种不 经过有性生殖过程， 经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构 与细胞核供体相同动物个体的技术， 与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克 隆。
核移植技术： 核移植技术：所谓核移植技术就是利用显微操作技
术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两 术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中， 个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造 个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换， 无性杂交生物新品种的一项技术。 无性杂交生物新品种的一项技术。
胚 胎 克 隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段 的胚胎，叫做胚胎克隆。 的胚胎，叫做胚胎克隆。 胚胎克隆 体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体， 体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体，叫做 体细胞克隆。 体细胞克隆。
二、两栖类细胞核移植
1938年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到 去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。 1952 1952年，Briggs和King沿用Spemann的思路和实验技术，首次 Briggs King Spemann 获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代．
核供体为囊胚期的胚胎细胞——实验成功 核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞——实验失败
1958年到 年到1962年，英国剑桥大学的 年到 年 英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer利用爪 和 利用爪 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾． 蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾． 1970年John Gurdon以同样的方法，用青蛙脚蹼角质化细胞进行移核 以同样的方法， 年 以同样的方法 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。 试验，蛙卵发育成了蝌蚪。
三、鱼类的核移植
从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍 鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移 植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细 胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细 胞核的影响．
1979年，中国科学院武汉水生物研究所 利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细 胞经过385天59代连续传代培养后，再
将此 种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受 精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了 两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。
1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细 胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同 种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核 鱼”新品种。
四、哺乳类的细胞核移植
1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实 验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只 单亲小鼠。
将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后 放入加有适量细胞松驰B的溶液中。 经此番处理的卵细胞的染色体复制后出现了两个核，将此 双核细胞放入正常培养液中培养。 卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。 将此种胚胎移入母鼠子宫培育。 生产出7只单亲小鼠。
1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室 合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们 将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经 培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕 鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可 育的个体。
五、核移植技术的一般操作程序
核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要 包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、 重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入 代孕母畜（寄母）等步骤 。
1．核受体细胞的准备
去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在 卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含 有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回 到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。 卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超 排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。二是从屠宰 场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在 体外培养成熟后作为受体。
2．核供体细胞的准备 ．
在核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二 在核移植操作中， 倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组； 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产 其次，供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下， 生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能 生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样， 重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外， 供体细胞主要有两大类：胚胎卵裂球和体细胞。另外， 核供体细胞的
来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 核供体细胞的来源还有胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。
3．细胞核移植
常用的核移植方法有两种， 胞质内注射和 常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注 射。胞质内注射是用一个外径5～8μm 的注核针吸取供体核 胞质内注射是用一个外径5 后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供 后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。 体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后 体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中， 用电刺激进行细胞融合。 用电刺激进行细胞融合。
4．激活 ．
卵母细胞的激活涉及的因素很多， 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵 母细胞激活还是人工的激活， 母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列 的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。 的反应，这些反应是胚胎发育所必需的。其激活原理是通过 电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来， 电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来， MII期中解放出来 并转到“受精”的状态。 并转到“受精”的状态。
5．重组胚的体内或体外培养 ．
经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养， 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养， 观察重组胚的发育率。 观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养 方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入 方法获得桑椹胚和囊胚， 休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4 7d， 休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和 囊胚。 囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内 培养7d，发育为囊胚。大鼠、 培养7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培 7d 养，发育至桑椹胚或囊胚。 发育至桑椹胚或囊胚。
6．胚胎移植
重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种 不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理， 按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。
六、 核移植技术的应用
1．制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产； ．制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产； 2．培育优良畜种，扩大良种种群 ； ．培育优良畜种， 3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物； ．开展异种动物克隆，拯救濒危动物； 4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆 ．与干细胞技术结合， 5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题 。 ．利用核移
植技术，
七、克隆羊与体细胞核移植
a.胚胎細胞株 b.胚胎纖維母細胞 胚胎細胞株, 胚胎纖維母細胞 胚胎細胞株 c.乳腺上皮細胞 d.PCR microsatellite 乳腺上皮細胞, 乳腺上皮細胞
第一步
取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白品种母羊） 的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠 状态而使全部基因具有活性。
第二步
注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑 面母绵羊）排卵，28~33小时取其未受精卵，快速去 28~33 核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其 进入G0期做受体细胞。
第三步
乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电 流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有 新的遗传物质的卵细胞。
第四步
新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内， 新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天 后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。 后发育为桑椹胚或囊胚（8~16个细胞）。 个细胞
第五步
将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，产下多利 即为6岁母羊的复制品，也为白色。
为何是突破性的工作： 为何是突破性的工作：
第一，解决了使供 体细胞与核受体细 胞（去核卵细胞） 同步的方法。 第二，解决了用体 细胞做核供体与转 基因的问题。
这一成果的重要生物学意义： 这一成果的重要生物学意义：
第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体 细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并 且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形 成完整个体。
第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体 细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复 制品。它的成功提示我们可以进一步做到，在培育 体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确 地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因， 再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化 的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就 是说，我们可以按照人的意志去改选、生产物种。
第三，在现代生物学领域中，沿有任何一项研 究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决 更多的问题的先例。多利羊的诞生及生长表明，利 用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突 破，在理论上已成为可能。
八、克隆技术存在的问题
理论问题 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭， 分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭， 细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； 细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚； 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。
克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。
实践问题
克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。 即使是正常发育的“多莉” 即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象
除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（ 除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤 其是在人胚胎方面的应用） 其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击 和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应 用。
二 : 第二节 细胞工程简介──动物细胞工程
第二节 细胞工程简介──动物细胞工程三 : 第四章、细胞与细胞工程
1、细胞的生物膜系统
1各种生物膜在结构上的联系： 2各种生物膜在功能上的联系：
3各种生物膜的化学组成大致相同（蛋白质、脂质、糖类）但含量有差别。
4生物膜系统的概念：细胞内由细胞膜、核膜、内质网膜、高尔基体膜、线粒体膜、质体膜等膜结构组成的统一整体。
5生物膜系统的功能：①使细胞具有一个相对稳定的内部环境，在物质的运输与交换及信息传递中起决定性作用；②增大膜的面积，供酶、核糖体等附着在上面，使各种化学反应有序的进行；③将细胞分隔成许多小区室，使各种化学反应能同时进行而不互相干扰。
6研究生物膜的重要意义：①理论上阐明细胞的生命活动规律②工业上成为人工模拟的对象（滤去盐分、处理污水）③农业上研究农作物的抗旱、抗寒、耐盐④医学上人工合成膜材料代替病变器官（人工肾）。
2、细胞工程简介
1细胞工程概念：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
2植物细胞工程
（1）细胞的全能性：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。细胞的全能性是细胞工程的原理。其物质基础是每一个细胞都含有本物种所有的全套遗传物质，具有全部的基因。受精卵的全能性最高，卵细胞已分化全能性较高，体细胞全能性比生殖细胞低。
分化实质上是基因在特定的时间和空间条件下选择性的表达的结果。
植物细胞在一定的营养物质、激素和其他外界条件下，就可表现出全能性。
植物组织培养： ①原理：依据细胞的全能性。
②过程：
脱分化 再分化
离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 根、芽 植物体
脱分化：由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物组织的脱分化（去分化）。
脱分化：是指已经分化的细胞失去其特有的结构和功能变成具有未分化细胞 （胚性细胞）特征的过程。
愈伤组织：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
再分化：是指已去分化的胚性细胞在某种诱导因素的激活下，再出现程序化的分化。
植物体细胞的组织培养是一种无性生殖
③植物组织培养的应用：快速培养、培育无病毒植株、生产药物、食品添加剂、香料、色素、和杀虫剂（紫草愈伤组织中可提取紫草素）、人工种子转基因植物的培育、植物体细胞杂交等。
（3）植物体细胞杂交：
①植物体细胞杂交的过程：
a.制备原生质体，用纤维素酶、果胶酶分解细胞壁。
b.诱导融合，注意物理方法的类型（离心、振动、电刺激）和化学方法的药剂——聚乙二醇。
c. 植物细胞a和植物细胞b杂交时，除了产生ab型融合细胞外，还可以产生aa、bb型，只不过这两种融合细胞不是人们所需要的类型。
d.筛选和组织培养。
②优点：可以克服远源杂交不亲和的障碍。
3动物细胞工程：常用的技术手段有：动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植。
（1）动物细胞培养： 细胞培养按细胞的来源不同可以分为原代培养和传代培养。
a. 原代培养：培养的细胞直接来源于动物的组织叫原代培养。动物的组织可以取自胚胎，幼小的动物或成年的动物，可以是病理性的，特别是肿瘤组织。具体做法是：先将组织尽量剪碎，然后用胰蛋白酶液消化成分散的细胞，过滤除去纤维类物质，再把细胞放到培养液中培养。
b. 传代培养：细胞在培养容器的表面长满后，可以用胰蛋白酶把细胞消化下来，使其分散为悬浮的单个细胞，用培养液稀释后，重新接种于新的培养容器中继续培养。传代细胞分为细胞株和细胞系两大类。
应用：大面积烧伤病人的皮肤细胞的移植。单克隆抗体的制备。
（2）动物细胞融合：细胞融合是指两个或两个以上的细胞融合为一体的现象。它可以是自然发生的或人工诱导的。自然界中细胞融合是经常发生的，有性生殖中精卵结合是其中的例子。人工诱导的细胞融合是利用诱导剂使细胞或原生质体融合在一起。动物细胞融合要求掌握的情况与植物相似。如过程、方法、诱导条件（剂）、结果等。动物细胞融合常常用到的诱导剂是灭活的仙台病毒，植物不用。
（3）单克隆抗体：抗体是由b淋巴细胞制造的。每一种淋巴细胞只制造单一特异性的一类抗体分子，但因为体内有大量的不同淋巴细胞，所以动物体内的抗体是一种混合物。如果能分离出单个的淋巴细胞，让它形成一个克隆，那么这个克隆的所有细胞制造的抗体都是一样的，这样的抗体叫单克隆抗体。但是，在体外培养的条件下，一个淋巴细胞是不可能无限增殖的。
①杂交瘤细胞的制备过程：首先用抗原免疫小鼠，然后取免疫小鼠的脾脏细胞（含有大量的淋巴细胞），与体外培养的骨髓瘤细胞混合，以聚乙二醇诱导融合。将融合后的细胞放到选择性培养基上培养，在这种培养基中只有杂交细胞可以成活，别的细胞死亡。将成活的杂交细胞克隆化培养，检测能否产生抗体。要获得单克隆抗体可以培养杂交瘤细胞，从培养液中分离抗体；也可以将杂交瘤细胞注射到小鼠的腹腔内，待其产生出肿瘤后，从腹水中分离出单克隆抗体。大量克隆抗体可以通过杂交瘤细胞的大规模培养来生产。
②单克隆抗体比起血清抗体的优点：首先，它特异性好，反应专一，只对单一的抗原决定起反应；其次，一旦制备成功，理论上就可以一劳永逸地大量生产抗体，不用这反复去免疫动物。
③单克隆抗体的医学应用价值：由于单克隆抗体的高度特异性，在医学检验中，被用来对各种传染病和肿瘤的诊断、治疗和预防具有重要意义。为了增强药物抗癌的选择性，可以制备针对肿瘤细胞的单克隆抗体，把一些毒素分子与此抗体相连，制成“生物导弹”，这样就可以将药物导向癌细胞靶子，不再对正常细胞造成伤害。
61阅读| 精彩专题| 最新文章| 热门文章| 苏ICP备13036349号-1