一 : 蛋白质工程：蛋白质工程-简介，蛋白质工程-基本途径

按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功能，常对已知的其他蛋白质进行模式分析或采取分子进化等手段。

所谓蛋白质工程，

蛋白质工程就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。

蛋白质工程_蛋白质工程 -简单介绍

蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每1种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的1个或2个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的1个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成1个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。

蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有2个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。

目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。

蛋白质工程_蛋白质工程 -基本途径

从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）

蛋白质工程_蛋白质工程 -特点

蛋白质工程在食品工业、日用品工业方面有广泛的应用前景。比如用经过改造的稳定性好的酶，可由价格便宜的棕榈油生产出价格昂贵的可可脂，从而创造很高的经济效益。荷兰一家公司设计了1种能和漂白剂一同起作用的去污酶，并且通过对这种酶上的2个氨基酸的修改，使这种酶具有较高抵抗力，在洗涤过程中不受破坏。因此，通过蛋白质工程可实现常规酶工程手段不能实现的目标。
在医学上，蛋白质工程也具有广泛的应用前景。比如，用人工手段去改造某些致癌基因的产物——蛋白质，使它失去致癌作用，从而开辟治疗癌症的新途径。中国的蛋白质工程具有国际先进水平，这些工程包括重组人胰岛素和溶血栓药物，重组人尿激酶等。
对动植物体内参与重要生命活动的酶加以修饰和改造，是蛋白质工程未来发展的1个重要目标。有朝一日，人们一定能够通过蛋白质工程来设计、控制那些与DNA相互作用的调控蛋白质，到那时，人为控制遗传、改造生命就不再是天方夜谭了。

蛋白质工程_蛋白质工程 -研究的核心内容

蛋白质结构分析

蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质（几毫克～几十毫克），制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。

另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，这种方法绕过了结晶、X－射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力于研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发
具有高度专一性的药用蛋白质。

结构、功能的设计和预测

根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在2个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

创造和改造

蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法：对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质侧链官能团，分割肽链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法：使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或连接不同化学基团，利用转酰胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用，缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成DNA，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。

蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肽键连接而成的肽构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列即可改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样即可将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标DNA明确以后，即可运用定位突变等技术来进行研究。

定位突变蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的1个或2个即可改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性或催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含1个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到2种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。

盒式突变1985年Wells提出的1种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在1个位点上产生二十种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成2个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理即可得到多种突变型基因。

PCR技术DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有1个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。

高突变率技术从大量的野生型背景中筛选出突变型是项耗时、费力的工作。有2种新的突变方法具有较高的突变率：

1、硫代负链法：核苷酸间磷酸基的氧被硫替代后修饰物（α－（S）－dCTP）对某些内切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成负链，然后用内切酶处理，结果仅在正链上产生“缺口”，用核苷酸外切酶III从3｀→5｀扩大缺口并超过负链上错配的核苷酸，在聚合酶作用下修复正链，即可得到二条链均为突变型的基因；

2、UMP正链法：大肠杆菌突变株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在这种宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）掺入模板而不被修饰。用这种含U的模板产生的突变双链转化正常大肠杆菌，结果含U的正链被寄主降解，而突变型负链保留并复制。

蛋白质融合将编码1种蛋白质的部分基因移植到另1种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在1种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人缘化抗体”等，就是采用的这种方法。

蛋白质工程_蛋白质工程 -实际应用

提高蛋白质的稳定性

葡萄糖异构酶（GI）在工业上应用广泛，为提高其热稳定性，朱国萍等人在确定第138位甘氨酸(Gly138)为目标氨基酸后，用双引物法对GI基因进行体外定点诱变，以脯氨酸（Pro138）替代Gly138，含突变体的重组质粒在大肠杆菌中表达，结果突变型GI比野生型的热半衰期长一倍；最适反应温度提高10～12℃；酶比活相同。据分析，Pro替代Gly138后，可能由于引入了1个吡咯环，该侧链刚好能够填充于Gly138附近的空洞，使蛋白质空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。

融合蛋白质

脑啡肽(Enk)N端5肽线形结构是与δ型受体结合的基本功能区域，干扰素（IFN）是1种广谱抗病毒抗肿瘤的细胞因子。黎孟枫等人化学合成了EnkN端5肽编码区，通过一连接3肽编码区与人α1型IFN基因连接，在大肠杆菌中表达了这一融合蛋白。以体外人结肠腺癌细胞和多形胶质瘤细胞为模型，采用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法证明该融合蛋白抑制肿瘤细胞生长的活性显著高于单纯的IFN，通过Naloxone竞争阻断实验证明，抑制活性的增高确由Enk导向区介导。

蛋白质活性的改变

通常饭后30～60min，人血液中胰岛素的含量达到高峰，120～180min内恢复到基础水平。而目前临床上使用的胰岛素制剂注射后120min后才出现高峰且持续180～240min，与人生理状况不符。实验表明，胰岛素在高浓度（大于10－5mol/L）时以二聚体形式存在，低浓度时（小于10－9mol/L）时主要以单体形式存在。设计速效胰岛素原则就是避免胰岛素形成聚合体。类胰岛素生长因子－I(IGF－I)的结构和性质与胰岛素具有高度的同源性和三维结构的相似性，但IGF－I不形成二聚体。IGF－I的B结构域（与胰岛素B链相对应）中B28－B29氨基酸序列与胰岛素B链的B28－B29相比，发生颠倒。因此，将胰岛素B链改为B28Lys－B29Pro，获得单体速效胰岛素。该速效胰岛素已通过临床实验。

治癌酶的改造

癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱症病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶(TK)可以催化胸腺嘧啶和其他结构类似物如GANCICLOVIR和ACYCLOVIR无环鸟苷磷酸化。GANCICLOVIR和ACYCLOVIR缺少3｀端羟基，即可终止DNA的合成，从而杀死癌细胞。HSV－TK催化GANCICLOVIR和ACYCLOVIR的能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中筛选出1种，在酶活性部位附近有六个氨基酸被替换，催化能力分别提高43和20倍。O6－烷基－鸟嘌呤是DNA经烷基化剂（包括化疗用亚硝基药物）处理以后形成的主要诱变剂和细胞毒素，所以这些亚硝基药物的使用剂量受到限制。O6－烷基－鸟嘌呤－DNA烷基转移酶O6－Alkylguanine－DNAalkyltransferase(AGT)能够将鸟嘌呤O6上的烷基去除掉，起到保护作用。通过反向病毒转染，人类AGT在鼠骨髓细胞中表达并起到保护作用。通过突变处理，得到一些正突变AGT基因且活性都比野生型的高，经检查发现1个突变基因中的第139位脯氨酸被丙氨酸替代。

嵌合抗体和人缘化抗体

免疫球蛋白呈Y型，由二条重链和二条轻链通过二硫键相互连接而构成。每条链可分为可变区（N端）和恒定区（C端），抗原的吸附位点在可变区，细胞毒素或其他功能因子的吸附位点在恒定区。每个可变区中有3个部分在氨基酸序列上是高度变化，在三维结构上是处在β折叠端头的松散结构（CDR），是抗原的结合位点，其余部分为CDR的支持结构。不同种属的CDR结构是保守的，这样即可通过蛋白质工程对抗体进行改造。

鼠单克隆抗体被人免疫系统排斥，它潜在的治疗作用得不到利用。嵌合抗体就是用人抗体的恒定区替代鼠单克隆抗体的恒定区，这样它的免疫原性就显著下降。如用于治疗直肠结肠腺癌（COLORECTALADENOCARCINOMA）的单克隆抗体Mab17－1A。尽管嵌合抗体还存在着免疫原的问题，但仍有几种嵌合抗体通过了临床实验。所谓人缘化抗体就是将抗原吸附区域嫁接到人抗体上，这样抗体上的外源肽链降低到最小，免疫原性也就最小。但是，仅将CDR转接到人抗体上，其抗原吸附能力很小，必须带上几个框架氨基酸残基，才能保持原有的吸附力。这样就存在免疫原性与抗原吸附力之间的矛盾。通过逐个氨基酸替代或计算机模拟分析，可在保持原有吸附力的基础之上，尽可能地降低免疫原性。第1个临床上应用的用于治疗淋巴肉芽肿病和风湿性关节炎的人缘化抗体CAMPATH－1H，尽管疗效显著，但仍有半数以上的患者有免疫反应。而其他人缘化抗体如治疗脊髓性白血病的ANTI－CD33等，其免疫反应可以忽略不计。

蛋白质工程_蛋白质工程 -蛋白质工程进展

当前，蛋白质工程是发展较好、较快的分子工程。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982—1985年间对酪氨酰—t—RNA合成酶的分子改造工作。他根据XRD（X射线衍射）实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进1步氧化生成 Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。工业用酶最佳pH的改变预示可带来巨大经济效益。蛋白工程还可对酶的催化活性、底物专一性、抗氧化性、热变性、碱变性等加以改变。由此可以看出蛋白工程的威力及其光辉前景。上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白工程的1类方法。另1类是以某个典型的折叠进行“从头设计”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α—螺旋组成为7三个氨基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。预测结构的模型法，在奠定分子生物学基础时起过重大作用。蛋白的一级结构，包含着关于高级结构的信息这一点已日益明确。结合模型法，通过分子工程来预测高级结构，已成为人们所瞩目的问题了。

蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。

蛋白质工程_蛋白质工程 -前景

蛋白质工程取得的进展向人们展示出诱人的前景。例如，科学家通过对胰岛素的改造，已使其成为速效型药品。如今，生物和材料科学家正积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面。用蛋白质工程方法制成的电子元件，具有体积小、耗电少和效率高的特点，因此有极为广阔的发展前景。

蛋白质工程_蛋白质工程 -相关词条

基因工程发酵工程酶工程细胞工程微生物工程

蛋白质工程_蛋白质工程 -参考资料

1.
2.新兴研究领域-蛋白质工程

二 : 08基地班蛋白质与酶工程复习思考题

蛋白质工程与酶工程复习思考题

（08基地班整理，答案仅供参考）

第一部分 蛋白质工程

1. 怎样理解蛋白质工程？

以蛋白质的结构和功能为基础，通过基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术。［www.61k.com］蛋白质工程正在形成以改造现有蛋白质和制造新型蛋白质为中心的第二代遗传工程。

2. 肽键是什么？

氨基酸之间脱水后形成的键为肽键，也为酰胺键

3. 一级结构与空间构象、功能之间的关系？

蛋白质的一级结构(primary structure)指它的蛋白质分子中各个氨基酸残基的排列顺序。蛋白质的一级结构决定了空间构象，空间构象决定了蛋白质的生物学功能，参与功能部位的残基或处于特定构象关键部位的残基对蛋白质的生物学功能往往起定性作用；一级结构相似的蛋白质，其折叠后的空间构象以及功能往往相似，一级结构的变化引起功能的变化。

4.天然蛋白质中主要的二级结构的类型有哪些？

蛋白质的二级结构：指蛋白质多肽链本身的折叠与盘绕方式,。

类型包括：α—螺旋、β—折叠、β—转角、自由回转等。

5.常见氨基酸的结构通式，20种常见氨基酸中有无不符合此通式的氨基酸？

除脯氨酸外，脯氨酸(Pro)的侧链R-基与主链N原子共价结合，形成一个环状的亚氨基酸，其他均具有如下结构通式。

R

|

H2N－C－C00H

|

H

6.什么是变性、复性？

变性：天然蛋白质因受到物理和化学的因素影响，使蛋白质严格的空间结构受到破坏，（但不包括肽键的裂解），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，这种现象称为蛋白质变性作用。

复性：变性的蛋白质恢复其天然活性的现象称为复性

7.常见的氢键发生在哪些基团间？

氢键: 由同一条肽链内每个氨基酸残基的两个肽键衍生而来，即每个氨基酸残基的N－H与前面每隔3个氨基酸残基的C=O形成的。

8.常见氨基酸的旋光性如何？

除甘氨酸外，都具有旋光性。从蛋白质水解得到的α--氨基酸均为 L--型氨基酸

9.分子伴侣定义及其功能？

分子伴侣：是进化上十分保守的蛋白质家族，广泛存在于多种生物体内，其主要作用是与新生肽或部分折叠的蛋白质的疏水表面结合，加速其折叠或组装成天然构象的进程，并防止其相互聚集和错误折叠。

10.维持蛋白质空间构象的作用力有哪些？

一级结构：肽键、二硫键（都属于共价键）

基地班是什么意思 08基地班蛋白质与酶工程复习思考题

二级结构：氢键（主链上—C=O—和N—H之间形成）

三、四级结构：二硫键、次级键（氢键疏水键、疏水键、离子键、华力、配位键）

11.设计的蛋白质二级结构如果是连续α螺旋时，要注意什么？

设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；

12.维持蛋白质二级结构的主要作用力是什么？

二级结构：氢键（主链上—C=O—和N—H之间形成）

13.血红蛋白的结构与功能。（www.61k.com］

血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成 。

血红蛋白一级结构变化而引起镰刀型贫血病。

血红蛋白的载氧气过程具有变构效应。

功能：血红蛋白的一级结构变化而引起镰刀型贫血病

14.进行蛋白质分子设计时，需要选择哪种类型的氨基酸用作核心？

(1)设计α螺旋时，应选择象Leu、Glu等易于形成α螺旋的残基；

(2)设计全β结构时，应选择Val、Ile等易于形成β折叠片的残基；

(3)而在设计转角时常选择Pro-Asn残基对。 （ Pro、Gly中断α螺旋，Glu中断β折叠）

15. 蛋白质分子设计的分类？

(1)定点突变或化学修饰法

(2)拼接组装设计法

(3)从头设计全新蛋白质

16.

17.亲和标记是什么？

亲和标记：借助亲和作用对目的分子进行标记的方法，多用于对蛋白质(如酶、抗体等)的标记。亲和性标记试剂是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物，能与天然底物或配体竞争蛋白质分子的结合位点，这类试剂具有高度的位点专一性。

17. 制造突变的主要分子生物学方法、原理？

基地班是什么意思 08基地班蛋白质与酶工程复习思考题

（1）定点突变 ：定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长

度的核苷酸片段。(www.61k.com]

几种寡核苷酸介导的基因突变方法：

①Kunkel 突变法 利用Kunkel 法以M13噬菌体DNA为载体进行寡核苷酸介导的位点

特异性突变

②基于抗生素抗性“回复”的突变方法

③基于去除特定限制酶切位点的突变

（2）蛋白质的体外分子定向进化

①易错PCR（Error prone PCR）：通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn2+和Mg2+的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。

② DNA 搅乱重组（DNA shuffling）：将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。

18. 蛋白质分子中容易进行反应的侧链基团有哪些？

巯基、氨基和羧基特别容易产生有用的取代。

19. 内含肽的定义。

内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显子连接成成熟的蛋白质。

20. 表达载体的基本构成。

（１）复制起始点

（２）选择性基因

（３）强的、可诱导的启动子

（４）强的转录终止序列

（５）核糖体结合位点

（６）合适的多克隆位点

21. 常用的蛋白质表达系统及优缺点。

（1）细菌表达系统培养方法简单、增殖快、生产成本低，但缺乏真核细胞特有的加工后处理，外源蛋白大量表达容易形成包涵体，而且在菌体中表达的外源蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏。

（2）酵母表达系统既具有原核细胞的增殖快、操作简单、成本低等优点，又可以象其他真核细胞一样完成对蛋白质转录和翻译后的修饰。但它的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产品产量降低。

（3）昆虫表达系统优点是能较高水平地表达不同动物来源的基因，能够有效地进行蛋白质翻译后的加工。主要缺点是不能连续合成重组蛋白，因为重组病毒感染昆虫细胞或昆虫幼虫4-5天后，细胞就裂解，幼虫即死亡。

（4）哺乳动物细胞是生产哺乳动物蛋白质最好的场所，其表达真核基因比其他几种表达系统更优越，能对蛋白质进行各种类型的加工和修饰，还能表达有功能的膜蛋白及分泌性蛋白。其缺点是组织细胞培养的技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长，成本较高。

22. 何谓报告分子？

基地班是什么意思 08基地班蛋白质与酶工程复习思考题

融合蛋白报告分子：将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选 ，如绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）

23. 测定蛋白质空间结构的主要方法？

（1）X射线晶体衍射技术：要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。[www.61k.com)

（2）核磁共振技术：能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。

（3）现代光谱技术

（4）三维电镜衍射技术

（5）动力学全精研究技术

24. 在测定蛋白质结构时，核磁共振技术NMR法的特点有哪些？

NMR可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。NMR的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶体衍射互为补充.

缺点：分辨率不高。能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。

25. 世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质是什么？

牛胰岛素

26. 蛋白质组的概念？

一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组.

27. 去污（垢）剂的作用？

去垢剂用来溶解经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团，（常用的去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等，其中CHAPS应用最普遍）。

28. 蛋白质进行质谱分析(MS)的简要过程？

离子源轰击样品→带电荷的碎片离子→电场加速(zeU)→获得动能(mv2)→磁场分离→检测器记录

其中，z为电荷数，e为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，v为电子运动速度。

29. 蛋白质的常用染色方法有哪些？

考马斯亮兰（Coomassie stain）

银染（Silver Stain ）

荧光染色（SYPRO Ruby protein gel stain）

负染

30. 离子交换层析的原理是什么？

离子交换层析的原理：样品中待分离的溶质离子，与固定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时，样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱，达到分离的目的。

蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。当pI < pH时，蛋白质带净负电荷； 而当 pI > pH时，蛋白质带净正电荷。阴离子交换剂本身带正电荷，阳离子交换剂本身带负

基地班是什么意思 08基地班蛋白质与酶工程复习思考题

电荷，因此蛋白质可以用阳离子交换剂或阴离子交换剂进行离子交换层析。［www.61k.com）

31. 盐析的定义。

盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出，常用硫酸铵进行沉淀。

32. 蛋白质分离纯化的一般步骤。

（一）材料制备

1、选材 2、破碎 3、混合物的分离

（二）粗分级

盐析、有机溶剂分级沉淀、超速离心法、等电点沉淀法、透 析——按照分子大小进行分离.分离取决于透析袋截留的分子量、超滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质

（三）细分级

凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、电泳法

33. 分子筛层析（凝胶层析）分离纯化蛋白质的原理？

凝胶层析原理：

（1）分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，

所以大分子物质迁移速度快；

（2）小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。

34. 溶液pH值与蛋白质等电点的关系？

等电点（pI）：蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。 当pI < pH时，蛋白质带净负电荷；

而当 pI > pH时，蛋白质带净正电荷。

35. 圆二色谱（CD）的原理是什么？

圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光吸光率的不同来分析蛋白质的结构。研究稀溶液中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。

36. 双向电泳的第一向、第二向各是什么，分别根据什么原理？

第一向：电聚焦电泳（IEF）根据蛋白质等电点的不同，将蛋白质加到含有不同pH值的两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶中，蛋白质样品在此凝胶中移动到与其等电点相同的pH梯度处后净电荷为零，在凝胶中不再移动，也就是相同等电点的蛋白质聚焦在相同pH梯度处，从而把不同等电点的蛋白质分开。

第二向：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），根据分子量大小对蛋白进行分离。

37. 蛋白质组学的研究方法有哪些?

蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译修饰、蛋白质功能确定、蛋白质与疾病的关系、蛋白质相互作用。 蛋白质组学的主要研究方法：

（1）双向电泳技术（2DE）

（2）计算机图像分析与大规模数据处理技术

（3）质谱技术(MS)

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第二部分 酶工程

1、Sumner、Fisher、Koshland、Henri、Michaelis和Menten、Jacob和Monod、Cech和Altmam及千畑一郎对酶工程学的发展做出的主要贡献是什么？酶工程发展历史中的关键事件？

Sumner——刀豆提取液中分离得到脲酶结晶，证明它具有蛋白质的性质，提出酶的本质是蛋白质的观点。[www.61k.com]

Fisher——锁钥学说

Koshland——诱导契合学说

Henri——中间产物学说

Michaelis和Menten——米氏方程

Jacob 和 Monod——操纵子学说

Cech和Altmam——核酶Ribozyme

千畑一郎——氨基酰化酶反应用于以D,L-氨基酸为原料的L-氨基酸生产，实现了酶连续反

应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。

酶工程的发展历史：

最早的酶学实验：1773年，意大利科学家斯巴兰让尼（Spallanzani）观察到，鸟的胃液能将肉类分解消化。

最早的酶制剂：1833年佩恩（Payen）和帕索兹 (Persoz) 从麦芽的水抽提物中，用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解成可溶性糖的物质，称之为淀粉酶（diastase），并指出了它的热不稳定性。

1897年，巴克纳兄弟（ Büchner）用石英砂磨碎酵母细胞，并制备不含酵母细胞的抽提液，用它能使蔗糖发酵，从而阐明了发酵是酶的作用的化学本质。揭开了20世纪酶学和酶工程学的发展序幕

1926年，Sumner首次从刀豆提取液中分离得到脲酶结晶，证明它具有蛋白质的性质，提出酶的本质是蛋白质的观点。

1930～1936年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶等的结晶并证实酶是蛋白质的化学本质。

1960年，Jacob和Monod提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。 1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为核酶——Ribozyme。

1949年，日本α-淀粉酶的深层发酵成功→工业化生产酶制剂

1969年，固定化酶应用获得成功，各种类型的酶反应器建立

2、酶的抑制剂类型及各种抑制剂的特点。

1、可逆抑制剂

（1）竞争性抑制剂：竞争性抑制剂的结构与底物结构相似，与底物竞争同一种酶的活性中心,从而影响E与S的结合。竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。特点：

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①I与S分子结构相似；

②Vmax 不变，表观Km增大；

③抑制程度取决于I与E的亲和力 ，以及[I]和[S]的相对浓度比例。（www.61k.com）

（2）非竞争性抑制剂：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。 特点：

①I与S分子结构不同；

②Vmax 减小，表观Km不变；

③抑制程度取决于[I]大小。

（3）反竞争性抑制剂：抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。特点：

①I与S分子结构不同，I只与ES结合

②Vmax 和表观Km都减小；

③抑制程度取决于[I]和[ES]二者的浓度。

2、不可逆抑制剂：

指抑制剂与酶活性中心基团以共价结合，引起酶活性丧失。抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合, 使酶丧失活性, 不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。

（1）非专一性不可逆抑制剂：指抑制剂可作用酶分子上的不同基团或作用于几类酶，如烷化剂碘乙酸等。

（2）专一性不可逆抑制剂：指抑制剂只作用于酶蛋白分子中一种氨基酸侧链基团或仅作用于一类酶，如有机汞专一作用于巯基。

3、培养基的五大要素。

碳源、氮源、无机盐、生长因子、水

4、培养条件对微生物产酶有影响，如何进行调节控制？

（1）pH值的控制：在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。

（2）温度的控制：细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度不同，不同的发酵时期需要

保持不同的温度。

（3）溶解氧的控制：调节通气量、调节氧的分压 、调节气液接触时间 、调节气液接触面积 、

改变培养液的性质

5、酶生物合成的模式及其生物学特征。

① 同步合成型，特点：

（1）酶的生物合成可以诱导，不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏；

（2）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止；

（3）酶所对应的mRNA很不稳定。

② 延续合成型（最理想的酶合成模式），特点：

（1）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；

（2）酶所对应的mRNA相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。 ③ 中期合成的特点

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（1）酶的合成受到反馈阻遏；

（2）所对应的mRNA不稳定。[www.61k.com)

④ 滞后合成型的特点

（1）在对数生长期不合成酶（可能是受到分解代谢物阻遏的影响）；

（2）所对应的mRNA稳定性高。

6、酶制备的一般流程？

1、材料的选择和预处理（动物、植物或微生物）

2、细胞破碎

3、酶提取

4、酶分离纯化（离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结

晶分离等）

5、酶浓缩、干燥

6、酶贮存

7、根据欲分离蛋白与杂蛋白分子大小的不同，可以采用哪些方法进行分离？

透析、超滤、凝胶层析、离心、 电泳

8、离心方法的分类？

1、差速离心

2、密度梯度离心（速度区带离心）

3、等密度梯度离心

9、凝胶层析中分配系数Ka表示什么？

Ve－Vo

分配系数Ka＝ ———

Vi

（峰洗脱体积 Ve：被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积

外水体积 Vo：色谱柱内凝胶颗粒间隙，亦称间隙体积

内水体积 Vi：凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，又称定相体积。 ）

Ka＝0时，Ve＝Vo 即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布为零（A）;

Ka＝1时，Ve＝Vo + Vi 即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为1（C）；

0 < Ka <1时， Ve = Vo + Kd * Vi 即表明分子受到部分排阻（B）。

10、双水相萃取中一般的双水相系统是有哪两部分组成？

双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。

可以构成双水相的体系有：(1)离子型高聚物－非离子型高聚物，如PEG－DEXTRAN

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（2） 高聚物－相对低分子量化合物，如PEG－硫酸铵

12、固定化酶的评价指标。［www.61k.com)

1、固定化酶（细胞）的活力：固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。表示为umol·min-1·mg-1。如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的反应初速度来表示，umol·min-1·cm-2。

固定化酶活力、固定化酶比活力、相对酶活力（P84）

2、酶固定化效率及活力回收率

固定化酶总活力

活力回收＝——————————×100％

被固定游离酶总活力

（加入总酶活力－未结合酶活力）

酶结合效率＝————————————————×100％

加入总酶活力

3、固定化酶（细胞）的半衰期

固定化酶（细胞）的半衰期是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。

13、固定化酶的性质与游离酶相比有哪些方面的变化，主要是哪些方面引起的？

1、酶稳定性的的变化，引起变化的原因：

（1）固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。

（2）抑制自降解。将蛋白酶与固态载体结合后，由于其失去了分子间相互作用的机会，

从而抑制降解并有利于提高稳定性。

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2、固定化酶最适温度的变化，引起变化的原因：

用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同

3、固定化酶最适pH的变化，引起变化的原因：

(1)载体的带电性质，带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高，带正电荷的

载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低

(2)产物酸碱性

酸性:

碱性: 固定化酶的最适pH值比游离酶的高 固定化酶的最适pH值比游离酶的低

4、固定化酶底物特异性的变化，引起变化的原因：

载体的空间位阻作用

5、固定化酶活力的变化，引起变化的原因：

（1）酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；

（2）固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；

（3）内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；

（4）包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。(www.61k.com]

6、米氏常数Km的变化，引起变化的原因：

固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。由于高级结构变化及载体影响引

起酶与底物亲和力变化，从而使Km变化。

14、各种固定化方法的优缺点。

15、为什么酶要进行分子修饰？

酶进行分子修饰的原因：

（1）稳定性（受蛋白酶水解）

（2）作用的最适条件（pH中性、室温、溶液状态）

（3）酶的主要动力学性质的不适应（ Km值大，与底物的亲和力小）

（4）临床应用的特殊要求（抗原性）

16、酶的哪些侧链基团可以进行化学修饰？

极性氨基酸残基

1、氨基修饰（赖氨酸残基） 2、羧基修饰（谷氨酸、天冬氨酸残基） 3、巯基修饰（半胱氨酸残基） 4、咪唑基修饰（组氨酸残基） 5、胍基修饰（精氨酸残基） 6、吲哚基修饰（色氨酸残基） 7、酚羟基修饰（酪氨酸残基） 8、甲硫基修饰（甲硫氨酸残基）

9、羟基修饰（丝氨酸、苏氨酸残基）

17、有机介质反应体系有哪些类型？

1、与水互溶的有机溶剂-水单相体系

2、非极性有机溶剂-水两相体系

3、非极性有机溶剂-酶悬浮体系

4、非极性有机溶剂-PEG修饰酶单相体系

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5、反胶束体系

18、有机介质反应体系中酶的性质有哪些改变？

一、有机介质体系中酶活性的变化，酶在有机溶剂中的活性比在水溶液里低。（www.61k.com］（原因：1、传

质障碍2、酶分子活性中心刚性的增加3、酶促反应活化能的增加）

二、酶的稳定性的变化：热稳定性提高、储存稳定性提高、对变性剂的稳定性提高

三、pH值特性

pH记忆：有机溶剂中的酶能够保持它冷冻干燥前或吸附到载体上之前所在缓冲液中的pH。

四、底物专一性（相对专一性、立体异构选择性、区域选择性、前手性选择性）

酶与底物的结合能取决于酶与底物复合物的结合能和酶、底物及溶剂相互作用能的差，因此酶与底物的结合受到溶剂的影响。

五、反应平衡方向的移动

19、如何选择合适的酶反应器？

影响酶反应器选择的因素很多，但一般可以从以下几个方面考虑：

①酶的形式(游离/固定化)

②固定化酶的形状

③底物的物理性质

④酶反应动力学性质

⑤酶的稳定性

⑥操作要求

⑦反应器制造、控制成本

20、生物传感器的分子识别机制。

①酶促反应

②免疫化学反应

③生物反应中的物理量变化

④微生物反应

21、定义：

①操纵子（operon）： 是基因表达的协调单位，一组功能上相关，受同一调控区控制的基因 组成的一个遗传单位。由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因组成，其功能是转录mRNA。 ②诱导酶： 某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行

的，被诱导合成的酶叫诱导酶。

③固定化酶：处于闭锁状态并能发挥催化作用的酶称为固定化酶。

④层析分离：利用混合物中各组分物理化学性质上的差异，使各组分以不同程度分布在两相中，它们以不同的速度移动，最终彼此分开。

⑤生物传感器：生物传感器是用生物成分作为感受器的传感器。生物传感器是以固定化的生物材料作为敏感元件，与适当的转换元件结合所构成的一类传感器。

⑥最适水含量： 在特定的有机介质反应体系中，催化速度达到最大时的含水量称为最适含水

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量

⑦ pH记忆(pH memory)：有机溶剂中的酶的最适作用pH与之冷冻干燥前或沉淀前相应的缓冲溶液的pH相当。［www.61k.com]

⑧反胶束：反胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体

⑨水活度（water activity，αw）：在一定的温度和压力下，反应体系中水的蒸气压与同样状态下纯水蒸气压之比。αw ＝P /P0，该参数直接反应酶分子上水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。

⑨阻遏酶：被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶

22、对照英文，写出对应的中文名称：

gel filtration chromatography 凝胶过滤层析、

SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、

aqueous two-phase system， 双水相系统

Ion exchange chromatography 离子交换层析

Salt-out 盐析

Salt-in 盐溶

Immobilized enzyme 固定化酶

Biosensor 生物传感器

23、对照中文，写成对应的英文缩写：

分批搅拌罐式反应器BSTR（Batch Stirred Tank Reactor）

连续搅拌罐式反应器CSTR(Continuos Flow Stirred Tank Reactor)

固定床式反应器Packed bed reactor，PBR

流化床型反应器Fluidized Bed Reactor，FBR

等电聚焦isoelectric focusing ，IEF

聚乙二醇PEG

单甲氧基聚乙二醇mPEG

聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE

24、现在酶工程领域的研究热点有哪些？请试述之。

国际酶工程研究领域的若干“热点”和前沿课题：包括基因工程和蛋白质工程的应用 ，人工合成酶和模拟酶 ，核酸酶和抗体酶 ，分子酶学 ，功能酶学 ，酶的定向固定化技术 ，杂交酶 ，分子发动机 ，酶化学技术，非水酶学 ，糖生物学和糖基转移酶 ，酶标药物 ，端粒酶 ，极端环境微生物和不可培养微生物的新酶种 ，酶在环境保护方面的应用等。

三 : 蛋白质工程概念及背景

一、概念

蛋白质工程(protein engmeenng)，是基于已知蛋白质的结构与生物功能之间的关系，运用生物信息学、计算机辅助设计、生物化学和晶体学等理论和方法，通过物理、化学和分子生物学等技术手段对蛋白质结构基因进行修饰或改造，生物表达合成具有特定功能的全新蛋白质的技术。

。www.61k.com)

二、蛋白质结构基础

蛋白质结构包括一级序列和二级、三级和四级结构。蛋白质一级序列是指蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，是由基因遗传密码的排列顺序所决定的。一级序列是蛋白质分子的基本结构，决定蛋白质的三维空间结构和相应的生物功能。

蛋白质的二级、三级和四级结构属于三维空间结构。蛋白质二级结构是指蛋白质分子中局部多肽链主链原子形成的特征拓扑结构，其基本构象单元包括α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲。氢键是维持蛋白质二级结构的主要次级键。超二级结构是指在多肽链内顺序上相邻的二级结构在空间折叠中相互作用而彼此靠近，形成有规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构主要有三种基本形式，即α螺旋组合(αα)、β折叠组合(βββ)和α螺旋β折叠组合(βαβ)，其中以βαβ组合最为常见。超二级结构的形成，主要是氨基酸残基侧链基团非成键相互作用的结果。结构域是指蛋白质三级结构中的独立折叠单元，通常是几个超二级结构单元的组合。

蛋白质的三级结构是蛋白质的一条多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲折叠而形成的三维空间结构。蛋白质三级结构主要通过氢键、疏水键、盐桥和范德华力等非成键相互作用保持稳定。对于单链蛋白质，三级结构即其特征性立体结构，体现了蛋白质的特性和功能。而对于多链蛋白质，具有三级结构的多肽链作为其亚基，尚不具有生物学活性，只有当其两条或多条多肽链问通过相互组合才能形成具有生物学功能的蛋白质四级结构。疏水键是维持蛋白质三级和四级结构的主要非成键。蛋白质的空间构象是其生物学功能的基础，构象发生改变，其功能活性通常也会随之发生变化。

三、蛋白质折叠

一个具有特定活性的蛋白质不仅有特定的氨基酸序列，还要有由此序列形成的特定三维空间结构。从多肽链的一级氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程，称为蛋白质折叠。在生物体内，生物信息的传递过程可以分为两个部分：第一步是通过存储于脱氧核糖核酸序列中的遗传信息的转录和翻译来表达合成获得蛋白质的一级序列，即分子生物学的中心法则；第二步是肽链经过折叠组装形成具有特定生物活性的蛋白三维结构。也就是说，遗传密码决定氨基酸序列，而氨基酸序列决定了蛋白质三维结构，蛋白质的生物功能则取决于其有效折叠的三维结构。

1.蛋白质折叠的热力学基础 实验证明，在给定环境(包括溶剂组分、pH值、离子强度、温度或其他成分的存在)中，天然蛋白质的构象是其相对于所有单键旋转自由度来说整体系统吉布斯自由能极小的结构状态。体外蛋白质复性实验，即变性蛋白质在一定环境条件下能自发折叠恢复到变性前的三维空间构象，从而重现其原有的生物活性，是建立上述原理的主要实验依据。1965年中国科学家用化学方法合成牛胰岛素，具有完全生物活性，证明在适宜条件下氨基酸序列可以自发形成其正确的空间构象并表现出相应活性。

另一方面，如果仅仅依据热力学的原理，蛋白质的折叠过程是一个完全自发的随机过程，那么多肽链在折叠过程中将需要尝试每个可旋转单键中的所有可能构象，直到整个蛋白系统处于接近自由能最小点的优势构象。考虑到蛋白质实际含有的可旋转单键数量，蛋白活性结构形成过程中进行构象搜寻所需要的时间会远远超过其实际折叠所需时间。此外，随着研究的深入，人们发现蛋白质的复性并不是完全可逆的，各种因素都有可能影响多肽链在体外的折叠效率。因此，蛋白质的折叠过程也必然受到动力学因素的调控。

2.蛋白质折叠的动力学基础 自20世纪80年代起，随着分子伴侣等生物大分子的发现，分子生物学研究逐渐证明细胞内多肽链的折叠一般来说都是有其他分子参与辅助的形成过程，而非完全的自组装过程，即辅助性组装学说。此学说认为，蛋白质的折叠是由辅助分子协同，经特定动力学途径形成具有生物功能的三维结构过程，而避免了随机组装中大量潜在的高能垒构象取样。因此，蛋白质折叠过程既是热力学的过程，也是动力学的过程。

有助于多肽链折叠的辅助分子主要是蛋白质，可分为两大类：折叠酶和分子伴侣。折叠酶包括二硫键形成酶、二硫键异构酶、脯氨酰顺反异构酶等。分子伴侣的作用机制目前尚不明确，但研究表明其不仅可以帮助多肽链折叠，还可能参与新生蛋白的转运、定位、亚基组装等多个蛋白质的成熟步骤。

四、蛋白质工程的研究策略及目标

蛋白质工程的基本任务就是确定蛋白质的结构与牛物学功能之间的关系，根据需要设计并表达合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质，优化特性及生物活性。其基本途径是从预期功能出发，设计期望的结构，推测相应氨基酸序列，通过诱变、定向修饰和改造等方法获得该序列的目的基因，在生物表达系统中表达合成新型蛋白质并检测其结构功能。

目前，蛋白质工程的主要目标是改善已知蛋白质分子的特性和功能缺陷，包括提高热稳定性及酸碱稳定性、增强抗氧化能力和抗重金属离子能力、改善酶学性质等。

本文标题：蛋白质工程-蛋白质工程：蛋白质工程-简介，蛋白质工程-基本途径
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