一 : 银行跨界重组基因：小学生善融资撞进电商丛林
从2012年6月28日，“善融商务”低调上线，中国建设银行电商跨界之旅已近半年;在深藏不露的交易数据背后，中国第二大银行，正在紧锣密鼓调动全行开展大规模的宣传营销活动，准备高调亮相。
站在2012年的尾巴上，电商+金融不再是阿里巴巴集团主席马云的个人梦想，其正在成为搅动传统金融的一股颠覆性力量。
银行拥有庞大的渠道和客户，还可以提供融资，面对高达数万亿、年均增长20%的中国电子商务市场这块蛋糕，银行没有理由拱手相让。建设银行的善融商务平台，无疑是第一个吃螃蟹的“巨无霸”。
作为闯入电商界的“大象”，善融商务旗下涵盖的企业商城(B2B)、个人商城(B2C)、房e通三大业务板块，这又是一个典型的类“阿里”帝国的雏形，有人甚至将其视为“阿里巴巴+京东(或天猫)+支付宝(建行网银)”的超级联合体。
“跟阿里巴巴、淘宝相比，建行还只是电子商务领域的小学生。”12月14日，一位建行高层如是对本报记者说，对于跨界电商，遭遇的难度和挑战，银行是有着清醒的认知的。
12月11-14日，本报记者亲赴上海、江苏苏州、浙江等地，通过对商业银行、电子商务、第三方支付、中小企业线上线下等大量调研，试图还原商业银行在电商领域“大象起舞”的种种故事与曲折。
银行跨界电商，“大象起舞”或许一开始步履尚缓慢，但长远看威力惊人。数据显示，善融商务上线六个月不到，目前，入驻商户已经达到8000多家。
高门槛入驻&零成本运营
建行很早就已着手选择包括上海、浙江、苏州等在内的13家分行展开内部试点，当时尚且形成一个完整的平台架构;而摆在分支机构面前的，首先要告诉客户，善融商务是什么?为什么要进驻善融商务?进驻善融商务有什么好处?
上海是试点分行之一。6月28日，善融商务上线首日，该行拉来了3C电商平台——易迅商城来做第一场体验活动;不过，建行上海分行电子银行部总经理龚山告诉记者，易迅一开始对建行做电商很不理解，“你们做你们的存款、贷款就好了，为什么要趟电商这趟浑水?”
龚山告诉易迅，建行出发点并不是靠电商卖东西，最终是为了以善融商务平台提供金融服务，而易迅采取的是直接开店的模式，其底端的供应商也有融资上的需求，双方一拍即合。
换句话说，易迅以加盟的形式加入善融商务平台，易迅的商户可以直接搬到善融商务，他们多了一个免费的销售渠道，同时，也为其供应商提供了融资便利，用龚山的话说，“你的还是你的，我的也是你的。”
在建行内部定义中，善融商务旗下的B2B业务，银行倾向于选择有一定规模、在行业或地区有一定影响力的直驻B2B商户和专业市场，专业市场要具有明确的市场管理方主体，能对下属商户紧密型管理。
建行上海分行人士告诉记者，“总体上，对商家的认证是比较高的，比如上市企业，注册资本300万以上的，很多是我们的存量信贷客户。”在初期客户拓展过程中，80%的为存量客户，其定位上市公司与品牌公司，而和知名电商合作也是一个路径。
半年的时间，建行上海分行拓展了200-300的商户，入驻的商户200左右，其中，B2B交易量为6000余万元，B2C交易量为200余万元。
善融商务平台免费，也是吸引商户入驻的重要原因。
在善融商务平台上，在淘宝、京东等传统电商上既有的入驻费、管理费、利润分成、营销广告费、推销费用等费用一律免除，此外，建行还提供面对面、在线的商户辅导服务。
一家服装生产企业告诉记者，以淘宝为例，淘宝交易费是5%，京东则是8%;聚划算的活动，每一笔交3%费用，高的话一天要8万，少的话也就是5万。“渠道免费，对于毛利润率比较低的服装企业无疑是有吸引力的。”
“自己做电商是一个烧钱的活。”EBT光大数码通信电子商务部总监王国庆告诉记者，他们有自己的网上商城，每年投入在100-200万上下，但收效甚微，建行的电商免费的平台对他们无疑是有吸引力的。
核心武器：基于交易数据的融资
不过，无论是免费的渠道，还是较高的信用度，对于银行电商平台而言，龚山告诉记者，最关键是把核心金融服务尽快搬到线上来。
在将近半年的运行过程中，信用卡分期和个人贷款等一些融资已经在开展，但相较而言，目前B2B上的企业融资案例还比较少。
“将核心企业引入善融商务平台，将供应链融资搬到网上。这需要很艰苦的工作，将供应链整个链条打通。”龚山说。
这意味着未来B2B商城的模式之一，就是供应链线上融资，如此，资金效率将大大加速，而传统供应链融资产品仓单质押、应收帐款、赊销模式……都可以搬到网上。
在建行总行人士看来，电子商务未来潜力最大的还是B2B的B，就是企业这一级，中小企业的融资确实比较复杂，银行必须对企业要有深层次的了解，既要了解法人情况、经营状况，又要了解日常的一些运作情况。
“银行不可能天天派人盯着企业，中小企业太多了，银行员工才多少?”建行电子银行部人士介绍，企业电子商务在线支付交易的信息，这是银行最为看重的。
简而言之，用户通过善融商务进行一系列交易行为，都能为银行提供更多参考依据用于给用户提升信用指数，从而和贷款额度相关联，为善融商务建立起良性可持续发展的信用机制。
信用机制建立后，客户需要贷款时，只要在平台上发出申请，就可以快速授信，立即获得贷款支持。
据建行人士介绍，只有客户交易达到一定程度，信用达到一定程度以后，一些诸如大企业担保、联保联贷等一些成熟金融产品，才可能向客户释放。
电商基因与银行基因的冲突
对于银行系电商而言，最大的困难是“摸着石头过河”。
“一开始对总行做电子商务并不理解，工作量非常庞大。”多位地方分行电子银行人士告诉本报记者。
在善融商务整体架构当中，电子银行作为牵头部门，负责整个善融商务的系统开发、平台建设、功能体验的改善、客户需求的反馈等推进工作;而善融商务业务推进一定是多部门联动的方式，电子银行部门需要与集团客户部、公司部、小企业部、个金部门倾力合作。
“善融商务最大的一个特点：总行平台一点接入，平台上所有功能都是由总行一揽子来解决，分行负责拓展。”建行上海分行人士告诉记者。
如此架构下，总行电子银行部相当于灵魂部队，同时配备有广州研发中心，负责业务需求架构;广州开发中心负责业务开发;此外，还在合肥还有一个业务中心，负责运营和维护，诸如在线提问，所有商户的入驻、图片发布等等都属于业务中心认证的。
而建行的行动力则来自于全国分支机构数以万计的客户经理，正如一位电子商务人士所言，这种模式下，银行客户经理都是拓展者，也是招商者，而一个专门的电子商务公司的营销团队不过百人。
“这一定是高度协同的。”龚山认为，传统的总分行之间的协调、区域协调，区域内部门协调，乃至部门KPI考核均需要予以调整和配套。
建行代表了银行系电子商务的一种尝试，而另外一种尝试，即通过曲线收购电子商务企业，进入电商的努力也在展开，接近工行浙江分行的人士透露，该行正在酝酿收购一家电子商务平台。
后者的优势也是显而易见，通过收购的方式，将电子商务平台与母体银行进行了区隔，进而在协调内部资源上，可以省去不少精力，而“即便到时候做不下，想要断臂代价也不至于太大。”
不过，银行做电商，大象要起舞，电商基因与银行基因的冲突是不可避免的，与专业电子商务公司相比，银行缺乏从事电子商务营销、宣传的经验，对市场需求的快速反应、根据客户的需求调整方案，及时上线等问题对银行管理体制来说都是巨大挑战。
“不管银行的平台多么强大，都需要尊重电商规律。一定要多搞活动，多搞促销。”龚山说。
二 : 脑内组胺及其功能意义的研究进展
摘 要：近年来对于中枢组胺能系统的研究,在组胺受体的分子生物学、组胺能系统的生理功能,以及组胺能神经传递功能的紊乱与某些脑疾病之间的关系等问题上取得了较大进展,本文对组胺生理功能的一些进展作一简要的综述。
关键词：组胺 组胺受体 中枢组胺能系统
组胺（histamine， HA）的化学名称为咪唑乙胺（imidazolethylamine）。早在本世纪初就已经从麦角中提出，其主要作用是引起平滑肌收缩、扩张毛细血管和刺激胃酸分泌。在外周结缔组织中的肥大细胞（mast cell）中，组胺的含量很高，参与炎症、过敏等局部病理变化。脑组织中也含有组胺，但由于脑内组胺含量很低，只相当于单胺类含量的1/10，加上研究方法的限制，以往对其在脑内的作用所知不多。直到70年代，灵敏的同位素测定技术的发展，很快累积了关于脑内组胺合成和分解的生化资料，据此便提出脑内组胺很可能起神经递质的作用的概念。接着，Garbarg等（1974）在下丘脑造成局限性损毁后，测定相应脑区组胺的代谢改变，论证了脑内存在有组胺能神经元系统的可能性。在80年代，利用免疫组织化学技术，成功的将组胺及其合成酶在细胞水平进行精确的定位，确定了组胺能神经元系统在脑内的分布。同时累积了组胺生化代谢的资料和组胺受体的药理学资料。进入90年代又成功地克隆出组胺受体。因此，将组胺作为一种神经递质或调质的概念，至此已经基本确立。
一、中枢神经系统组胺
脑内组胺主要存在于神经元和肥大细胞两个储存库。相对于其它组织，脑内的肥大细胞含量比较少，主要集中在丘脑和垂体，其数量随种属、性别和生理状态差别较大。目前认为，在绝大多数其它部位，神经元释放的组胺起主要作用。
脑内组胺的分布在各个脑区之间是不均匀的，以下丘脑的含量最高，小脑的含量最少。同位素实验证明，组胺不能透过血脑屏障，脑内的组胺直接从组氨酸（L-histidine）生成。从外周注射标记的组氨酸，可在脑内检测到组胺，说明从外周进入脑内的组氨酸可以生成组胺。脑内合成组胺只有简单的一步，即由组氨酸脱羧而成。这一过程由组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase， HDC）催化，以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate）作为辅酶。
二、组胺受体
1966年，Schild等把豚鼠回肠上对抗组胺药敏感的受体称为H1受体，以后英国SK研究所的Black等在豚鼠子宫平滑肌及胃液分泌细胞上发现了H2受体。1983年Arrang等发现在释放组胺的中枢和外周组胺能神经元的突触前膜上还存在H3受体。2000年则首次发现并成功克隆了H4(www.61k.com］受体。近年来，由于分子生物学技术的飞速发展，有关组胺受体的研究取得了很大进展。
三、中枢组胺的生理功能
（一）组胺及其受体对呼吸形式的影响
近年来，许多学者通过对不同种属、不同发育阶段的动物进行研究，一般认为HA对呼吸节律主要起兴奋作用。lzumizaki等[1]对小鼠注射组氨酸脱羧酶特异抑制剂a-FMH（a-fluoromethylhistidine），引起高温小鼠呼吸频率下降，呼气时间延长，提示中枢组胺参与了体温升高所引起的呼吸频率的上升和呼气时间的缩短。中枢组胺能神经元可能参与了呼吸形式的形成。Miyamoto等[2]通过对非麻醉状态下，迷走神经切断前后，处于高碳酸血症状态下的野生型小鼠和H1受体基因敲除小鼠的研究，发现随着PaCO2的增加，两种基因型小鼠每分通气量增加幅度相同，但是H1受体基因敲除小鼠比野生型小鼠对呼吸频率增加的反应较低，但是对潮气量增加的反应较高，从而推测中枢组胺可能通过H1受体影响呼吸形式的形成。
（二）组胺及其受体对学习记忆的影响
组胺和组胺受体在大脑皮质、海马、杏仁核等这些与学习记忆有关的脑区有高密度的分布。研究表明组胺对学习记忆的影响十分复杂，许多行为学研究出现不一致的结果。有研究发现，脑室内注射组胺能够增强或损害主动回避反应中大鼠的学习记忆能力；而组胺合成酶的抑制剂a-FMH也能够增强或损害大鼠在八臂迷宫中的空间学习记忆能力。此外，组胺受体的相关药物所获得的结果也同样不一致，如组胺H1受体拮抗剂增强水迷宫中的学习记忆，却损害了八臂迷宫中的学习记忆；而H1受体敲除小鼠的在被动回避反应任务中的学习记忆能力没有改变[3]。另外，组胺对学习记忆三个阶段获得、巩固和再现的作用也并不甚一致，脑室内注射组胺能够增强主动和被动回避反应的获得过程，而在同样的行为学模型中组胺反而损害其巩固和再现，损毁TM增强这些过程；同样，整体或脑室内注射a-FMH降低组胺水平，也有增强或损害记忆获得两方面的报道。
突触可塑性与学习记忆密切相关，通常被认为是它的神经生物学基础。也有部分研究表明，组胺可能参与突触可塑性的调节。组胺能够作用于NMDA受体NR2B亚单位的多胺位点，增强海马NMDA受体介导的突触传递。随后Brown等发现，在离体脑片上组胺也能够直接作用于NMDA受体，增强LTP的诱导[4]。组胺H1受体可能通过调节镁离子的阻滞作用增强皮层神经元的NMDA受体电流；而在高钙低镁的情况下，组胺可以作用于H2受体激活cAMP/PKA通路，引起神经元长时程的兴奋性增强，H1受体和NMDA受体也可能参与此过程的调节；另外，组胺也可能作用于H3受体，在海马DG区抑制谷氨酸释放从而影响神经元的兴奋性。总体上，外源性组胺主要起增强突触传递的作用。
（三）组胺对觉醒的作用
一系列研究证明组胺参与觉醒。例如，下丘脑的损毁或失活能引起嗜睡， H1受体的拮抗剂能够增加慢波睡眠的时间，以及HDC基因敲除小鼠出现清醒时间减少、注意下降和对新环境的探索行为减少等。组胺在脑内的释放随其行为状态的改变发生变化，并与组胺能神经元放电相一致。除了其直接作用外，组胺还能够通过刺激基底前脑的胆碱能神经元和中缝背核的5-羟色胺能神经元来调节皮质的活动，这些作用由H1受体来介导。在皮质和杏仁核中，组胺和H3受体激动剂调节乙酰胆碱的释放，而后者被认为参与觉醒和注意力的维持[5]。组胺的释放是应激和觉醒的敏感指标，增加组胺释放能够维持觉醒状态，这种效应是通过H1受体起作用的，在H1受体敲除的小鼠这种效应消失。
（四）组胺及其受体对摄食行为的影响
向脑室注入组胺或H1受体激动剂抑制大鼠的摄食行为，H3受体阻断剂thiop-eramide也抑制动物的进食，而注入H1受体阻断剂可有效增强大鼠进食。已知室旁核中一些下丘脑神经元末梢释放的去甲肾上腺素可有效地刺激进食，而组胺可以抑制室旁核中去甲肾上腺素的释放从而抑制进食[6]。
（五）组胺及其受体对痛觉的影响
组胺虽然是外周伤害性刺激物，但中枢组胺能系统也有下行纤维支配脑干中与痛觉调制有关的中缝背核和中脑导水管周围灰质。在脑室内注入组胺有镇痛效应。大部分研究显示组胺的抗伤害性刺激作用可能是激活了H2受体，因为组胺注射到中缝背核或导水管周围灰质引起的镇痛效应被西咪替丁阻断，而H2受体激动剂dimaprit也有镇痛作用。H1 受体基因敲除小鼠的痛阈升高，说明激活H1 受体会使机体对伤害性刺激的反应增强[7]。也有人观察到，低剂量的H1 受体激动剂FMPH降低痛阈。上述结果表明组胺可能从外周和中枢两个方面参与痛觉过程。
（六）中枢组胺对内分泌功能的影响
三 : 基因敲除技术研究进展_刘建忠
??4
2006,Vol.23No.2
化学与生物工程
Chemistry&Bioengineering
基因敲除技术研究进展
刘建忠1,敖??敬1,田为宇1,马季骅2
(1.武汉科技大学化工与资源环境学院,湖北武汉430081;2.武汉科技大学医学院,湖北武汉430081)
????摘??要:基因敲除技术是研究功能基因作用的重要方法,是后基因组时代的重要研究内容。从基因敲除的细胞基础、基因敲除载体的构建及发生同源重组干细胞的筛选、基因敲除动物模型的建立、基因敲除与基因拯救、国内基因敲除技术的研究现状等方面概括了基因敲除技术的研究进展和该技术目前存在的主要问题。
关键词:基因敲除;功能基因;动物模型
中图分类号:R587??Q943????????文献标识码:A????????文章编号:1672-5425(2006)02-0004-03
????2003年4月14日,美国联邦国家人类基因组研究项目负责人在华盛顿宣布,始于1990年的国际人类基因组计划经美、英、日、法、德和中国科学家的不懈努力比原计划提前两年完成。通过实施人类基因组计划,得到了人类几乎全部基因的核苷酸序列,但对于大多数基因的功能却知之甚少。基因敲除(Geneknockout)是借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法,通过胚胎干细胞这一特殊的中间环节将小鼠的正常功能基因的编码区破坏,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成为后基因组时代的重要研究方法和内容。
的动物个体,通过行为观察、生理生化指标检测等手段可以揭示该基因的作用。
迄今为止,只有小鼠干细胞的建系方法最成熟、效果最稳定,因此小鼠是基因敲除研究的唯一的实验动物模型[2]。
2??基因敲除载体的构建及发生同源重组干细胞的筛选
2??1??基因敲除载体的构建
构建特定基因的敲除载体必须深入了解该基因的结构组成,如组成该基因的核苷酸序列、外显子和内含子数目、特定位点的限制性内切酶的种类以及该基因在染色体上的定位等。William等[3]希望研究腺苷酸环化酶刺激性G蛋白(Gnas)基因突变的可能结果,该基因有13个外显子,被定位在人类染色体的20q。用包含小鼠Gnas基因外显子1部分序列的片段为探针,从文库中筛选出包含Gnas其它外显子的克隆,从中获得了一个长为6??0kb、两端为BamHI酶切位点的片段,该片段包含翻译起始位点AUG上游2??0kb到第2外显子中部的核苷酸序列。将该片段克隆到pBluescriptII上,并以之为基础构建敲除载体。用NcoI和Nrul双酶切上述片段,将位于AUG附近和第1外显子之间500bp的片段切除,并插入作为筛选重要标记的新霉素抗性基因(neoR),从而构建了用于实现Gnas基因敲除的载体。
2??2??发生同源重组的干细胞的筛选
筛选发生了同源重组的干细胞的方法主要有以下三种。
13??1??13??2
1??基因敲除的细胞基础??????胚胎干细胞
胚胎干细胞(Embryonicstemcells,ESC)是早期胚胎细胞经体外抑制分化培养建立的多能性细胞系,体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖,在发育上类似于动物早期胚胎的内细胞团细胞,具有与早期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性状遗传机制的理想模型[1]。
ESC是进行基因敲除研究不可替代的材料。目前,虽然体外培养乳腺细胞、胎儿成纤维细胞等细胞类型的技术都已相当成熟,对这些类型的细胞进行基因组修饰也是完全可能的,但ESC的另一特性是其它任何类型的细胞都不具备的,那就是当将一定数目的ESC注入囊胚期小鼠的囊胚腔后这些细胞可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成,在此基础上,通过检测和选配,筛选出基因组中正常基因被破坏
基金项目:湖北省教育厅青年基金资助课题(2004D016)收稿日期:2005-09-14
作者简介:刘建忠(1967-),男,陕西吴堡人,副教授,博士,主要研究方向为动物生物技术。电话:027??86534651,E??mail:jzhli??
yahoo.com.。
刘建忠等:基因敲除技术研究进展/2006年第2期
??5
因整合进宿主基因组时的方式多为两头插入,根据这一现象Mario设计了长度大于10kb的载体,其中包含neoR基因,而在距离发生同源重组较远的位置上有一个由单纯疱疹病毒基因启动子驱动的胸苷激酶基因(HSV??tk)片段。先用G418筛选整合了经过改造的载体的克隆,这是正选择。接下来,对于随机整合的克隆其tk基因能得到表达,可检测到相应的表达产物。而发生了同源重组的克隆其HSV??tk基因经过反复传代势必丢失,也就不可能有表达,从而检测不到tk基因表达的产物,即负选择。2??3??影响同源重组效率的因素
目前报道的影响同源重组效率的因素主要是外源基因转染的方式。据报道,采用显微注射的方法,在经G418筛选出的克隆中,发生同源重组的概率为1/150,而采用电转化的方法时,经G418筛选出的克隆中,发生同源重组的概率仅为1/300。基因敲除的技术路线见图1
。
[4]
[4]
2??2??1??Southern杂交
该方法的原理很简单,即用特定的限制性内切酶消化从经过扩增的干细胞中提取的基因组DNA,用敲除载体为探针,对于发生了同源重组的干细胞克隆和随机整合了敲除载体的干细胞克隆,其Southern杂交结果不同,杂交出的条带有差异。William等[3]用pvuII消化来自每一干细胞克隆的DNA,然后与经标记的敲除载体杂交,对于随机整合的克隆可以杂交出一条大小为2??0kb的条带,而发生了同源重组的克隆则杂交出了2??0kb和2??4kb的两条带。2??2??2??PCR扩增
采用在经过改造的载体中插入一小段寡聚核苷酸(约29bp)序列,该序列正好与基因组基因上的一小段序列组成一对PCR引物,这样通过PCR扩增产物的大小即可区分同源重组和随机插入。
2??2??3??正负选择
该方法筛选同源重组克隆的依据是对于线性化的外源基因片段无论采用电转化还是显微注射,外源基
[4]
图1??基因敲除的技术路线
Fig.1??Thetechnicalrouteforgeneknockout
3??基因敲除动物模型的建立
Eddy等
[5]
显差别。这样的公鼠与经雌激素处理过的母鼠混养过夜,能见到阴栓的个体极少。ERKO公鼠由于雌激素受体基因缺失出现了交配频率降低、精子数量减少、精子发生紊乱等现象。
Hu等
+/-[6]
将雄性小鼠的雌激素受体基因敲除,以
研究雌激素受体基因对公畜繁殖性能的影响。结果表
明,雌激素受体基因被敲除的雄性小鼠(ERKO)在解剖学上是正常的,但这样的雄性小鼠不育。成年ER??KO公鼠附睾中的精子远少于正常公鼠,3~5月龄时部分ERKO公鼠精细管中有精子生成,但多数ERKO公鼠的精细管膨胀为空腔,腔内有一些组织紊乱的上皮细胞。10月龄ERKO公鼠的精细管与野生型公鼠的精细管无明显区别,附睾尾精子生成以及存活的数量也与野生型公鼠接近。10月龄以后,ERKO公鼠精囊腺、凝集腺、前列腺以及附睾在形态学上是正常的,但精细管内精子的发生出现紊乱和退化。血清中T将小鼠的卡巴B蛋白抑制因子的激酶1
-/-
(IKK1)基因敲除以研究该基因的功能,结果表明,IKK1个体的表型是正常的,但IKK1个体出现了
四肢突兀、头小于正常小鼠、无外耳、表皮无皱褶等异
/-常现象。IKK-1个体能够发育到出生,但出生后/-30min内死亡,出生时IKK-1个体较正常个体小,心
脏、肺、肝脏、脾脏、脊椎、头颅均异常。
4??基因敲除与基因拯救
Li等[7]将小鼠ESC中的卡巴B蛋白抑制因子的激酶2,IKK2(+/-
),杂
??6
合体在各个方面都是正常的,通过杂合个体之间的交配,研究者在很长时间内未能得到该位点纯合的个体,
/-即IKK-2个体。在杂合状态时IKK2的表达只是受到了影响,但依旧有表达,而一旦纯合就意味着该基因的表达完全被中断,或者说即便有表达,表达出的蛋白质
/-也不再是正常的IKK2。随后的研究表明,IKK-2属致死基因型,该位点纯合的个体在胚胎发育的早期(12??5~13??5d)死亡。原因是当无IKK2表达时,胎儿产生肿瘤坏死因子??(Tumornecrosisfactor????,TNF????)引起早
期胎儿的肝细胞发生大量凋亡,而在正常情况下,IKK2可抑制TNF????引起的肝细胞凋亡。那么能否拯救这样的纯合子个体呢?通过IKK2
+/-
:基因敲除技术研究进展/2006年第2期
12??5%的个体表现为单肾,表明Smad3基因对小鼠肾脏的形成有一定的影响。
6??目前存在的主要问题
基因敲除研究中存在的主要问题有以下几个方面:其一,基因定向敲除的成功率很低,检测发生同源重组干细胞的工作比较困难。其二,尽管小鼠的繁殖周期为19~21d,但从定向敲除干细胞基因到筛选出具备理想基因型的基因敲除小鼠模型依旧耗时极长。其三,基因敲除后的功能可能被其它基因的代偿作用填补,因此并不表现表型缺陷。
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与TNF????基因被敲除
+/-
的杂合子小鼠交配,获得了IKK2TNF????
-/-
/TNF????
+/-
的个体,
-/-
通过这种基因型的公母鼠的交配获得了IKK2
的个体。观察表明,IKK
-/-2
和
/TNF????
-/-
的个
体可以存活到出生,但出生后一月内死亡。
5??国内基因敲除技术的研究现状
戴旭明等[8]将线性化的针对小鼠凝血因子IX基因的敲除载体用电穿孔法转入小鼠ES细胞,经G418
筛选,用PCR和Southern杂交的方法从具药物抗性的细胞中筛选出4个凝血因子IX基因被定向敲除的ES细胞克隆,为进一步开展基因敲除研究打下基础。陈广文等采用PCR扩增的方法研究了从美国德克萨斯大学引进的热休克因子1(Heatshockfactor1,HSF1)基因敲除小鼠的基因型。结果表明,采用PCR扩增的方法,野生型小鼠仅在562bp的位置出现一条带,突变纯合子则在377bp处出现一条带,而突变杂合子则在562bp和377bp处出现两条带。李雪岭等[10]构建了可用于大鼠次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因敲除的载体。王冬平等采用解剖学和血清学指标测定的方法研究了Smad3基因敲除对小鼠肾功能的影响,结果表明,该基因敲除的纯合小鼠
[11]
[9]
TheResearchProgressinGeneKnockOut
LIUJian??zhong1,AOJing1,TIANWei??yu1,MAJi??hua2
(1.CollegeofChemicalEngineering,Source,andEnvironment,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430081,China;2.CollegeofMedicalScience,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430081,China)Abstract:Geneknockoutwasaveryimportanttechniquetostudytherolesoffunctionalgenes,anditwasalsoaveryimportantresearchbranchinthepost??genomeperiod??Inthispaper,thecellbasisforgeneknockout,theconstructionofthevectorforgeneknockoutandthescreeningoftheembryonicstemcellswherehomolo??gousrecombinationoccured,theanimalmodelsmadeaftergeneknockout,geneknockoutandgenerescue,theresearchprogressofgeneknockoutathomeandtheproblemsexistedwerebrieflyintroduced??
Keywords:geneknockout;functionalgene;animalmodel
四 : 羟基和超氧自由基的检测研究进展70
第２９卷，第４期２００９年４月
光谱学与光谱分析
ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓ
Ｖ０１．２９。Ｎｏ．４．ｐｐｌ０９３—１０９９
Ａｐｒｉｌ，２００９
羟基和超氧自由基的检测研究进展
张昊，任发政。
中国农业大学食品科学与营养工程学院，教育部一北京市功能乳品实验室，北京１０００８３
摘要活细胞在必需的新陈代谢过程中会产生自由基，越来越多的研究证据表明，这些自由基涉及到许多体内调控系统，然而一旦有过多的自由基生成便会氧化细胞脂膜、蛋白质、ＤＮＡ和酶，进而对细胞造成致命性的损伤。此外，研究还表明许多疾病与自由基密切相关，例如，有研究报道海氏默症病人脑中生物分子的氧化损伤程度明显高于正常值，另外癌症可能也是ＤＮＡ受到氧化损伤的结果。因此，测定自由基的方法就显得十分必需和重要。文章重点对羟基和超氧自由基检测技术的发展情况进行了讨论，涉及的自由基检测技术主要有分光光度法、荧光法、化学发光法和电子自旋共振技术，并评价了各种方法的优缺点。关键词羟基自由基；超氧自由基；检测技术；评述中图分类号：０６５７．３
文献标识码：Ａ
ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２００９）０４－１０９３－０７
羟基苯甲酸，用其在５１０ｎｌＴＩ处的吸光度值表示ｏＨ?的多
引
言
羟基自由基（ＯＨ?）和超氧自由基（０２一?）是生物体内
少，吸光度值与ｏＨ?的量成正比［１］。１．１．２铁氧化邻二氮菲法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生ＯＨ?，羟自由基使邻二氮菲一附＋氧
化为邻二氮菲一Ｆｅ３＋，使邻二氮菲一Ｆｅ２＋在５３６ｎｌｎ处的最大吸收峰消失。根据５３６
活性氧代谢产生的物质，其中Ｑ一?经一系列反应最终会生成０Ｈ?，而ｏＨ?是一种氧化性很强的自由基，可以引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使糖类、蛋白质、核酸及脂类等发生氧化损伤。研究表明肿瘤、心血管、衰老等许多疾病与自由基相关。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。本文主要介绍了目前常见的测定羟基和超氧自由基的检测方法：包括分光光度法、荧光法、化学发光法、电子自旋共振技术等，并评价了各种方法的优缺点和应用范围。
ｍ处吸光度变化判断受试物清除
ＯＨ?的能力。需要注意的是，测定时加样方法对结果有重要影响，需先将邻二氮菲、ＰＢＳ及水混匀，并且每管加入ＦｅＳ０４后立即混匀，否则会使局部颜色过浓，影响结果的重复性‘２１。
１．１．３细胞色素Ｃ氧化法
其反应机理为ｏＨ?能使还原型细胞色素Ｃ（浅红色）氧化成氧化型细胞色素Ｃ（浅黄色）通过测定反应体系中吸光度的减少量（５５０ｎｍ），间接测得ｏＨ?的含量。１．１．４脱氧核糖法
采用Ｆｅ３＋一ＥＤＴＡ－抗坏血酸一过氧化氢体系产生ＯＨ?。
１分光光度法
利用自由基使显色剂发生颜色变化，根据吸光度的变化值而间接测得自由基的含量是分光光度法的基本原理，下面将分别介绍几种常见的羟基和超氧自由基的测定方法。１．１羟基自由基１．１．１水杨酸法
Ｆｅｎｔｏｎ反应产生０Ｈ?，ＯＨ?氧化水杨酸得到２，３－－－
收稿日期：２００７一ＩＩ一２８。修订日期：２００８－０３－０６
基金项目：国家“十一五”科技支撵项目（２００６Ｂ伽）０５Ａ１６）资助
此方法中脱氧核糖作为ＯＨ?的攻击目标。脱氧核糖受ＯＨ?攻击后裂解，在酸性、加热的条件下可与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物。可根据在５３２ｎｌＴｌ处测定的吸光度值来间接反映ｏＨ?的含量【３】。１．１．５萃取一催化氧化光度法
．
利用混合稀土溶液催化Ｈ。Ｑ产生０Ｈ?，ｏＨ?氧化
二苯基碳酰肼，生成红色二苯基碳酰腙，其最大吸收波长是
５６３
ｎｌｎ。当二苯基碳酰肼浓度一定时，吸光度值与（）Ｈ?呈
作者简介：张昊，１９８４年生。中国农业大学食品科学与营养工程学院硕士研究生
＊通讯联系人ｅ－ｍｍｌ：ｒｅｎｆａｚｈｅｎｇ＠２６３．ｎｅｔ
ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｖｉｄｌｈａｏ＠ｓｉｎａ．ＯＤＩｎ
万方数据
１０９４
光谱学与光谱分析
第２９卷
量效关系，从而间接反映ＯＨ?的含量‘“。
另外还有许多研究者利用不同显色剂检测ＯＨ?，详细介绍见表１。
在酸性条件下，亚硝酸与氨基苯磺酸和Ｎ－甲奈基二氨基乙烯反应生成红色化合物，后者在５５０ｎｉ－ｎ处有最大吸收峰，测定在５５０ｍ＇ｎ处的吸光度变化，可以间接的反映Ｑ一?的含量，但是该方法存在一定的缺点，如甲萘胺溶液不稳定、空白值较大等。
总体上来说，分光光度法操作简单，费用少，仪器设备价格低廉，但存在检测的灵敏度较低，检测限较高，专一性不强等缺点。
Ｔａｂｌｅ１
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ
１．２超氧自由基
超氧自由基的分光光度法测定，最常用的方法有细胞色素Ｃ的超氧自由基还原法【１２Ｊ和硝基阴氮唑篮（ｎｉｔｒｏ
ｂｌｕｅ
ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＮＢＴ）还原法Ｌｌ３｜。具有氧化活性的细胞色素Ｃ被０２一?还原后，形成了在波长５５０ｕｒｎ处有强吸收的亚铁细胞色素，可以用于（）２一?的测定［１“。但是，细胞色素Ｃ还原法的体系中如果存在着其他还原性物质便会对结果造成干扰，如还原性酶的干扰。同样，ＮＢＴ在０２一?的作用下，还原生成不溶于水、蓝色的二甲替（Ｄｉｆｏｒｍａｚａｎ）［１３］，它的最大吸收波长５６０ｎｎｌ，吸光系数达１００００以上，测定灵敏度相当高。有研究者在进行Ｋ１０４一Ｈｚ０２化学发光反应体系的机理过程中，使用ＮＢＴ反应测定０２一．?获得良好的结５１。但是，由于二甲替不溶于水，长时间放置会出现沉淀近些年，还不断有研究者报道新的测定方法。比如田益ｒｕｘｌ、
另外分光光度法测定（）２一?的方法还有邻苯三酚自氧?反应，从而
７．４）环境下测定，而缺点在于６一羟多巴胺氧ｎｎｌ处。肾上腺索红的产量可间接测出反应体系的（）２一?
万方数据
用荧光光度法来检测自由基的含量时，使用的捕获剂
荧光减弱的捕获荆
方光荣等研究了ＯＨ?与Ｃｅｓ＋的反应，表明在酸性条ｎｎｌ，Ｍｎ２＋一Ｈｚ０２体系在碱性介质中产生的羟自由基０２荧光法测定羟自由基的新体系，激发波长和发
张海容等通过Ｃｕ＋催化过氧化氢一抗坏血酸反应体系产２荧光法
２．Ｉ荧光光度法
在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。在常见的捕获剂中，荧光强度减弱的捕获剂有Ｃｅｓ＋、罗丹明６Ｇ、水杨基荧光酮，而荧光增强的有苯甲酸、Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应等，下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。
２．１．１
果［１现象，难以应用于测定（）２一?随时间增长其动态的变化。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ等报道了利用水溶性ＮＢＴ衍生物测定０２一?的方法，解决了生成物沉淀所导致的测定困难问题Ｌｌ引。
玲等建立了一种利用动力学分光光度法测定中药对超氧阴离子自由基清除率的新方法。研究表明：当波长为５２０
件下，有强荧光的Ｃｅ３＋被氧化生成无荧光的Ｃｅ４＋。测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量，该方法可作为筛选抗氧化剂的方法［ｚ１１。碱性介质中罗丹明６Ｇ能产生特征荧光，其最大激发波长和发射波长分别为３５０和５５０可以迅速氧化罗丹明６Ｇ使其荧光猝灭，如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基，便会使溶液的荧光猝灭程度降低，据此建立了测定抗氧化活性的方法［２２１。任凤莲等人的实验发现Ｃｏｚ＋与Ｈｚ（）２反应生成羟自由基的产率比Ｆｅｎｔｏｎ试剂高１００倍以上。采用水杨基荧光酮（ｓａｌｉｃｙｌｆｌｕｏｒｏｎｅ，ＳＡＦ）一
Ｃｏｚ＋＿Ｈｚ射波长为５１０和５００咖，测定体系在反应前后的荧光变化，
可间接测定羟自由基的产生量ｍ】。除了这几种常见的捕获剂外，还有一些研究者采用了其他的试剂，荧光素钠本身能产生特征荧光，其激发波长和发射波长分别为４９１和５１２ｎｎｌ。在碱性介质中，Ｍｎｚ＋。Ｈ：０２体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭［２４］。张爱梅等提出检测Ｆｅｎ—ｔｏｎ反应产生羟自由基的方法。羟自由基与吖啶红发生反应后，吖啶红的荧光强度减弱，测定其荧光强度的变化，可问接测定羟自由基的产生量［ｚ５１。２．１．２荧光增强的捕获剂
生羟自由基模型，根据羟基苯甲酸的荧光大小对比研究了亚硝酸钠、槲皮素和红色素对羟自由基的清除能力。结果表明：高粱红色素、亚硝酸钠、槲皮素对ＯＨ?自由基的清除能力呈一定的量效关系，亚硝酸钠、槲皮素优于红色素对羟
黄嘌呤氧化酶浓度为４×１０１越?ｎ１Ｌ一１，反应时间在２～７
ｍｉｎ时，可得到最佳测定条件［１”。
化［１８１、没食子酸自氧化Ｌ１９Ｊ、６一羟多巴胺自氧化、肾上腺素氧化法Ｌ２０ｊ和羟胺氧化法等。其中邻苯三酚自氧化是最经典的方法，但其机理十分复杂。没食子酸自氧化的测定受ｐＨ与没食子酸的浓度影响较显著，所以测定时要严格控制ｐＨ且要准确配制规定浓度的没食子酸溶液。此外样品中的其他低分子量氧化还原性物质也会直接与（）２
影响测定结果的准确性。６一羟多巴胺自氧化的优点是可在生理ｐＨ值（ｐＨ化的线性区间非常有限，而且ＯＨ?和Ｑ一?都可以使６一羟多巴胺自氧化，因此测定的专一性不高。肾上腺素氧化法以肾上腺素氧化为肾上腺素红作为（）２一?生成的指标。测定
３１０
自由基的清除能力。探讨了红色素、槲皮素、亚硝酸钠的猝
灭机理，表明红色素、亚硝酸钠为动态猝灭，槲皮素为静态猝灭过程‘２６］。谷学新等利用Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的羟基自由基氧化ＤＭＳ０生成的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Ｈａｎｔｚｓｅｈ反应，产物３，５－Ｚ．乙酰一１，４－－－氢吡啶产生特征荧光，其最大
含量。该法操作简便，而且灵敏度可以设法增加，但干扰因素较多。在羟胺氧化法中．０２一?可氧化羟胺生成亚硝酸根，
第４期
光谱学与光谱分析
激发波长和最大发射波长分别为４１９．４和５０５．５ｎｎ］。通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量‘２７１。
２．２荧光探针法
随着科学技术的发展，目前在自由基的研究领域中很多情况下需要测定细胞内自由基的含量，应用荧光探针法便可以达到这一目的。荧光探针法测定技术的核心是荧光探针，探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光，能很容易通过细胞膜，但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。此法的优点是操作简便、快速、方便且重复性好，可在单细胞水平对细胞内活性氧进行定位定量的动态监测，因此这一方法最近发展最为迅速。但该方法目前尚未完全成熟及标准化，所使用的设备较为昂贵。
常用的荧光探针有２，７－－－氯荧光黄乙酰乙酸（２，７－ｄｉ－
ｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＤＣＦ－ＤＡ）、双氢罗丹明
１２３（ＤＨＲ）、二氢乙锭（ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ，ＨＥ）等。ＤＣＦ－ＤＡ具有亲脂性，很容易通过细胞膜，进入细胞后在细胞内脂酶
的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的Ⅸ：ＦＨ，但ＤＣＦＨ
不产生荧光，细胞胞浆中的氧化物能够氧化ＩＸ３ＦＨ为能发出很强荧光的２，７－－＂氯荧光素（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ＤＣＦ），ＤＣＦ形成量与细胞氧化物水平成正比例关系，因此，其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。研究表明，ＩＸ；Ｆ－ＤＡ探针可被多种活性氧如（）２一?、０Ｈ?、过氧化亚硝基等氧化形成ＤＣＦ，因此ＤＣＦ的荧光强度应是细胞内活性氧产生的总体状况的反映。ＨＥ能自由透入细胞内被０２一?直接氧化成溴化乙锭（ＥＢ），ＥＢ的荧光强度与（）２一?浓度成正比，从而间接反映（）２一?的含量。Ｃａｔｔｅｒ等（ＣａｔｔｅｒＷ
０，ｅｔ
ａ１．Ｊ．Ｌｃｕｋｏｅ．Ｂｉ０１．，１９９４，５５（２）：２５３．）用ＨＥ作探针测得的结果表征０２一?的含量。使用ＤＣＦＨ－ＤＡ与ＤＨＲ时，仪器的激发波长４８８ｎｌｎ，发射波长在５２５或５３０ｎｌｎ左右；使用ＨＥ时，仪器的激发波长４８８ｎｌＴＩ，发射波长在６１０或
６５０
ｎ／ｎ左右。测胞浆内自由基，往往用ＤＣＦＨ—ＤＡ探针；而
测线粒体内的自由基，则常用ＤＨＲ作荧光探针［２８。。
Ｔａｎｇ等合成了用于（）２一?识别的新型荧光探针试剂２一吡啶甲醛苯并噻唑啉，该探针试剂只能被（）２一?氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对Ｑ一?具有专一性，由此建立了流动注射荧光法测定０２一?的方法［２９。。之后他们又合成了新的荧光探针试剂香草醛缩－８－氨基喹啉，建立了新的测定０２～?的方法，并用于一串红植物衰老过程中０２一?产生速率的测定［３０］。
荧光探针法的实际操作中，应注意以下几个问题：（１）探针在水溶液中易水解，应用无水乙醇或ＤＭＳＯ配制，４℃保存，１周内使用；（２）荧光探针在光线的照射下易被氧化。另外，还受孵育温度的影响，所以染色时需要３７℃避光孵育。样品应在染色２ｈ内上机检测，避免荧光减弱，影响实验结果；（３）细胞与探针的孵育时间必需足够，因为细胞内自由基的绝对水平很低，孵育时间过短很难显示出不同细胞间自由基水平的差异；（４）实验中应设立阴性对照，以避免细胞自身荧光对实验结果的干扰；（５）细胞应保持良好的
万方数据
活性状态，贴壁细胞在消化处理时要尽量温和、快速。ＰＢＳ漂洗时间不必过长，以保持细胞活性，并且保证细胞内游离探针有一定的浓度。
３化学发光技术
化学发光测定法是仪器分析中灵敏度最高的方法之一，已在医学、环境以及工业分析等许多领域里得到广泛的应用‘ｓ¨。自由基的化学发光研究也是自由基测定法研究领域中比较活跃的分支之一。化学发光的原理是从一个化学反应（一般是氧化反应）中获得能量，使反应物或产物分子的电子激发，形成电子激发态，当返回基态时，以发射光子的形式释放能量，这一过程称为化学发光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，
ＣＬ）。
常利用化学发光技术间接检测食品、药品以及生物制剂中自由基清除剂，评价它们的抗氧化能力。其优势是利用了发光试剂与自由基反应后能直接发光的原理，根据光强度，确定自由基的含量。
最常用的发光试剂为鲁米诺（Ｌｕｍｉｎ０１），鲁米诺在碱性溶液中（ｐＨ１０左右），首先形成单价阴离子，然后在催化剂，如酶，Ｆｅｚ十，Ｃｏｚ＋，Ｎｉ２＋和Ｃｕ２十等过渡金属离子或者金属络合物的催化下与溶液中的溶解氧或者过氧化氢发生氧化还原反应，生成激发态的两价阴离子氨基肽酸盐（ＡＰＤ），ＡＰＤ经非辐射性跃迁回到基态时。放出光子。检测光的强度就可以确定自由基含量。Ｚｈａｏ等以Ｌｕｍｉｎｏｌ为发光试剂，检测茶叶中的茶色素清除超氧自由基与羟基自由基的能力，并将其清除能力与茶多酚进行比较。研究表明，茶色素清除（）２一?和ＯＨ?的半数清除浓度达到０．０８和０．００３ｍｇ?ｍＥ－１，其清除能力以及动力学过程与茶多酚相似［３２。。
自从Ａｌｂｒｅｃｈｔ报道了鲁米诺的化学发光现象以来∞３。，直到今天鲁米诺的化学发光反应机理仍然没有得到令人满意的阐释。近年来，有研究者在研究金属过氧化物的化学发光时发现，在不存在任何催化剂的条件下，向ＢａＯ或者ＭｇＯ固体粉末中注入鲁米诺溶液，仍然可以观察到很强的发光现象Ｌ３“，这一发现已被应用于以鲁米诺衍生物ＡＢＥｌ作为标记物的化学发光柱后测定法［３引。利用固一液非均相化学发光体系，在弱酸性或者非缓冲介质条件下，同样能够观
察到鲁米诺与过氧化氢的发光现象。这些结果表明，鲁米诺
发光与否与鲁米诺溶液的酸碱度似乎没有直接的关系，介质的酸碱度只会影响激发态ＡＰＤ的发光强度和发光波长，发光与否更多地取决于活性氧的生成条件【３引，所以从理论上来说，鲁米诺化学发光法可以应用于各种不同介质中０２一?和０Ｈ?的测定，但同时这就导致了测定选择性差的问题。
另一种较常用的发光试剂是光泽精（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ），在发现鲁米诺化学发光后不久，Ｇｌｅｕ等首次报道了光泽精化学发光‘３７］。在碱性条件下，光泽精与（】２一?等过氧化物作用形成激发态Ｎ－甲基吖啶（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ）。利用光泽精化学发光法也可检测细胞线粒体内特定种类的自由基：光泽精通过其本身的正电荷与线粒体内膜上负电荷之间的作用
１０９６
光谱学与光谱分析
第２９卷
通过线粒体膜线粒体内膜后首先被还原成单价光泽精自由基，然后光泽精自由基与０２一?反应生成不稳定的中间物并分解出激发态分子，激发态分子跃迁到基态的过程中释放光子，通过微弱发光仪测定发光强度，以此间接测定（】２一?的生成及数量。相比之下，光泽精对于自由基测定的选择性较高，有许多报道光泽精只有在超氧活性自由基存在下才发生发光现象。但是在实际应用中，ＨｚＱ的分解过程同样会产生（＿）２一?自由基，可能会影响结果的准确性。
还有一类特殊的化学发光试剂，化学名称为２－ｍｅｔｈｙｌ一６－ｐｈｅｎｙｌ一３，７－ｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏ－［１，２－ａ］ｐｙｒａｚｉｎ－３－ｏｎｅ，简称
ＣＬＡ，早先是由Ｓｕｇｉｕｒａ等合成Ｌ３８ｊ的。ＣＩＡ的特点是不与生物机体内的Ｈｚ０２或者ｏＨ?发生反应，只与咙?发生
特异性的化学发光反应，发光波长为３８０ｎｍ［３９］。Ｏｓｍａｎ等在ＣＬＡ化学发光系统中加入吐温２０，在０．６％（ｐ）的浓度时，ＣＬＡ的发光强度增加了２．７倍，使检测黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶体系产生０２一?的灵敏度提高到ｎｍｏｌ?Ｌ１［４…。Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ等还开发了ＣＬＡ的衍生物ＭＣＬＡ和ＦＣＬＡＥ４ｌＪ，Ｎａｋａｎｏ和Ｆｕｊｉｍｏｒｉ等对这一类试剂的化学发光机理和反应动力学作了详细的研究，报道了ＣＩ。Ａ和ＭＣＬＡ与活性氧的化学反应机理Ｌ４２“引。ＦＣＬＡ是目前化学发光试剂中发光波长（５３２ｎｍ）最长的试剂，发光效率比ＣＩ．Ａ高出近１０倍，由于这一特点，在进行生物样品中０２一?测定时，能够有效地降低酶、ＯＨ?等干扰物质的影响。
其他用于检测自由基的化学发光试剂还有ＰｈｏｌａｓｉｎＥ“］和Ｌｕｍｉｎｏｌ类似物等Ｌ４５“６｜。
２０世纪６０年代发展的电子顺磁共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇ—
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ）（也称电子白旋共振（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｓｐｉｎ
Ｙｅｓ—
对于亚硝基类化合物，被捕集的自由基直接加到亚硝“等利用了ＭＮＰ的这一优点，通过ＥＰＲ检测ＭＮＰ自捕集所产生的自由基的超精细耦合常数的改变，研究了硝酮类自旋捕集剂主要有ＤＭＰＯ和ＰＢＮ，自由基加在万方数据
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（ａ）亚硝基类
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Ｆｉｇ．１
Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｓｏｆｔｒａｐｐｉｎｇｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ
ｏｆ刚ｎ
ｔｒａｐｓ【蜘
ＤＭＰＯ具有良好的水溶性，利于实验操作和溶液配制，更重要的是ＤＭＰＯ与（）２一?和ＯＨ?反应后，所测定到的ＥＳＲ谱图有明显的差别，能够快速地鉴别出（）２一?和ＯＨ?。但是这个方法也存在着它的不足之处，与（）２一?形成的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＯＨ在生理条件下，会逐渐地转变为与ＯＨ?的自由基附加生成物ＤＭＰＯ－ＯＨ类似的ＥＳＲ信号，使得（）２一?和ＯＨ?的判断成为困难，Ｋｏｈｎｏ等采用向测定体系中添加ＤＭＳＯ的方法良好地解决了这一问题［４８］。Ｈｏｊｏ等以ＤＭＰＯ作为体内ＯＨ?捕集剂，用ＥＳＲ自旋捕集技术间接检测小鼠血液中的体内ＯＨ?［４９３。Ｒｏｕｂａｎｄ等报道一种新的ＤＭＰＯ的衍生物，ＤＥＰＭＯ这一试剂可与０２一?形成稳定的自由基附加生成物（半衰期约１５ｍｉｎ），这种生成物具有特征性的１２个峰的ＥＳＲ信号，易于定性判
断嘲。
Ｒｈｏｄｅｓ等以ＰＢＮ为甲基自由基的捕获剂，检测一系列常数Ｌ５１ｊ。当所要研究的自由基为羟自由基时，由于羟自由的甲基自由基，然后再用自旋捕集剂捕获甲基自由基，并用ＥＰＲ技术进行研究。Ｔａｋｅｓｈｉｔａ等用ＤＭＳＯ来捕获大鼠体内获甲基自由基，通过ＥＰＲ间接检测了羟自由基的含量，该自由基不能用ＥＰＲ检测Ｌ５３｜。
自旋捕集技术的局限性是：有些自旋捕获剂对生物体随着自由基在生物体系中研究的不断深入，人们更需ｓｐｉｎ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅ
ｉｍａｇｉｎｇ，ＥｓＲｌ）应
维生素Ｅ型的抗氧化剂与自旋捕集剂竞争甲基自由基的反应，快速测定了不同物质的活性大小以及与自由基的结合基极不稳定，因此通常用ＤＭＳＯ来捕获它产生一种较稳定通过ｘ＿射线产生的羟自由基，生成甲基自由基，以ＰＢＮ捕结果为研究人类受辐射伤害的程度提供了一定的参考Ｌ５２。。过去大多数研究认为ＤＭＳＯ被自由基氧化只生成了一种更稳定的甲基自由基，但是Ｑｉａｎ等的研究表明。甲基自由基不是ＤＭＳＯ被氧化产生的唯一的碳自由基，除了?ＣＨ３，还有?０ＣＨ。，?ＣＨ２（）Ｈ和?ＣＨ２Ｓ（（））ＣＨｓ，只是后几种有毒，有些易受到血脑屏障限制，无法到达自由基生成的组织部位；捕集产物不稳定，寿命不长（只有几分钟到几十分钟），易被猝灭，必须在捕获自由基后立即对其检测；被捕获的自由基不专一，ＥＳＲ信号随时问衰减不稳定，噪声干扰严重。
４．２电子自旋共振成像
要了解自由基在生物组织、器官中的空间分布信息，电子自旋共振成像技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎ
４电子自旋共振
４．１自旋捕集
ｎｅｔｉｃ
ｏｎａｎｅｅ，ＥＳＲ））技术在光化学、电化学、高聚物、核辐射以及生物学领域中已得到广泛的应用。其检测自由基的原理
是用某一反磁性化合物——自旋捕捉剂与不稳定的自由基
反应产生一种相对稳定的可用ＥＰＲ检测的自由基，一般称之为自旋加合物，利用自旋加合物的ＥＰＲ常数来研究自由基的电子结构。常用的自旋捕集剂为氮氧化合物，主要为亚硝基类和硝酮类。
基的氮上［见图１（ａ）］。所形成的自旋加合物的ＥＰＲ谱可以反映被捕自由基的超精细结构，对鉴别被捕自由基十分有利。常用的捕集剂是２一甲基一２一亚硝丁烷（ＭＮＰ）。
对一叔丁基环芳烃与自由基相互作用的情况。此类捕集剂存在的缺点是对热和光不稳定，并容易二聚而失去捕集作用。而且以（）为中心的自旋加合物极不稳定‘４７］。
捕集剂的碳原子上形成加合物［见图ｌ（ｂ）］。
第４期
光谱学与光谱分析
１０９７
运而生。根据成像的方式不同可分为：三维（３Ｄ）梯度磁场法、扫描ＥＰＲ显微镜法、轴向检测ＥＰＲ法和双共振成像法。
利用３Ｄ－ＥＰＲＩ技术，以ＴＰＩ。氮氧自由基为标记物，可清晰地获得自由基浓度随主动脉血管距心脏间的距离增加而减弱，对心脏的分辨率可达到亚毫米水平［５“。Ｓｈｉｎ－ｉｃｈｉ等给大鼠腹腔内注射一种稳定的氮氧自由基一３一氨甲酰基一２，２，５，５－四甲基一ｌ一氧一吡咯啶（氨甲酰基－ＰＲＯＸＹＩ。），在大鼠脑部获得一个持续的自由基信号，然后将大鼠头部置于ＥＳ－ＲＩ系统的谐振腔中，通过磁场扫描，获得了大鼠脑部的３Ｄ切片ＥＳＲＩ图像［ｓｓ３。Ｔｏｇａｓｈｉ等对大鼠尾静脉注射氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＬ，利用ＥＳＲＩ系统观察了大鼠腹腔氨甲酰基一ＰＲ（）ＸＹＬ分布的２Ｄ和３Ｄ图像。在此基础上，通过ＣＣＩＡ诱导肝损伤，使氨甲酰基一ＰＲＯＸＹＩ。的代谢速率降低，又成功获得了活体大鼠肝脏的２Ｄ和３Ｄ图像口引。Ｍａｓｕｍｉｚｕ等用氮氧自由基溶剂给大鼠灌胃，观察到这种自由基首先到达胃部，然后被转运到肝、肾和心脏的动态图像【５引。另外Ｐａｎａｇｉｏｔｅｌｉｓ等利用射频轴向ＥＳＲＩ技术观察了肝、肾、膀胱等不同组织的氧分布图像［５引。ＥＳＲＩ不仅可以观察自由基在组织的空间分布，还可以观察自旋标记物在组织中的代谢情况。如Ｓａｎｏ等采用该技术研究小鼠静脉注射不同结构的亲脂性氮氧自旋探针，获得了不同结构化合物透过血脑屏障的速度与规律，从而为活体动态研究脑组织中的自由基或药物代谢提供了新途径。
尽管ＥＳＲＩ技术在生物医学领域中应用已有诸多报道，
参
１Ｉ＝ｌ
基于其成像原理和技术本身特点，仍有许多不利因素限制了ＥＳＲＩ的应用。比如，样本自由基的谱线较宽，为达到一定的分辨率所需的梯度场强度高；生物体内含有各向异性的顺磁性物质，从不同方向进行磁场扫描时所获得的谱线易发生偏移；由于电子与原子核的相互作用，易产生超精细结构的ＥＳＲ谱线等。但这些困难必然随着人们研究的深入而逐步被克服，其发展前景非常广阔。
５展望
自由基研究已经与许多研究领域结合在一起。在食品科学领域，自由基研究可为食品中的抗氧化成分及其作用机理的研究提供有价值的参考，筛选抗氧化剂；在医学领域，生物机体的某些疾病与自由基密切相关，研究自由基的
产生、消亡过程可以进一步探讨疾病的发生原理，从而为疾
病诊断治疗提供理论依据；在药学领域，研究药物与自由基的相互作用、动力学过程，可为新药物的开发提供理论基础；在环境科学领域，能够利用自由基的强氧化性来实现环境中有机物的降解、转化等过程，为治理环境污染提供了一条新途径。然而从以上介绍的各种方法来看。能够直接测定自由基的方法相当有限，且到目前为止化学反应法和捕获法的分析选择性和可信度还难以令人满意。因而迫切需要开发高灵敏度、高选择性的自由基测定方法，特别是体内自由基的测定，对于解释生命机体的各种生理、病状等有着重要的意义。
考文
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第４期光谱学与光谱分析１０９９ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｘｙｌａｎｄＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅＲａｄｉｃａｌｓ
ＺＨＡＮＧＨａｏ，ＲＥＮＦａ－ｚｈｅｎｇ。
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＤａｉｒｙ。ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎａｎｄＢｅｉｊｉｎｇＣｉｔｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｅｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ
ＡｂｓｔｒａｃｔＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｉＳｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓ．ＴｈｅｒｅｉＳｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ
ａｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｓｕｃｈｓｐｅｃｉｅｓｉｎｖａｒｉｅｔｙｏｆｎｏｒｍａｌｉｎｖｉｖｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｓｙｓｔｅｍｓ．Ｗｈｅｎａｎｅｘｃｅｓｓｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｉｓｆｏｒｍｅｄ．ｔｈｅｙ
ｃａｕｓｅｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅａｎｄｌｅｔｈａｌｃｅｌｌｕｌａｒｅｆｆｅｃｔｓｂｙｏｘｉｄｉｚｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅｌｉｐｉｄｓ，ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＤＮＡ
ｈａｓｂｅｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｔｈａｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｐｌａｙｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ
ｐｒｏｂａｂｌｙａａａｎｄｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｏｌｅｉｎａｎｕｎｌｂｅｒｏｆｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ，ｍａｎｙｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｏａｌｌｔｈｅｍａｊｏｒｃｌａｓｓｅｓｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｃａｎｃｅｒｉＳｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅＤＮＡｄａｍａｇｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌａｒｅｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔａｎｄｎｅｃｅｓｓａｒｙ．Ｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌａｎｄｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌｓｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄｗｉｔｈ６２ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｐａｐｅｒ，ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍａｉｎｌｙｉｎｃｌｕｄｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ，ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｉｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｉｒａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＨｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ；Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌ；ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＲｅｖｉｅｗ
（ＲｅｃｅｉｖｅｄＮｏｖ．２８，２００７；ａｃｃｅｐｔｅｄＭａｒ．６，２００８）
＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ
敬告读者——《光谱学与光谱分析》已全文上网
从２００８年第７期开始在《光谱学与光谱分析》网站（ｗｗｗ．ｇｐｘｙｇｐｆｘ．ｃｏｍ）“在线期刊’’栏内发布《光谱学与光谱分析》期刊全文，读者可方便地免费下载摘要和ＰＤＦ全文，欢迎浏览、检索本刊＂－３期的全部内容；并陆续刊出自２００６年以后出版的各期摘要和ＰＤＦ全文内容。２００９年起《光谱学与光谱分析》每期出版日期改为每月１日。光谱学与光谱分析期刊社
羟基和超氧自由基的检测研究进展
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：
被引用次数：张昊， 任发政， ZHANG Hao， REN Fa-zheng中国农业大学食品科学与营养工程学院,教育部-北京市功能乳品实验室,北京,100083光谱学与光谱分析SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS2009，29(4)1次
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相似文献(10条)
1.期刊论文 杨春宝.潘家祜 Prousion对氧自由基的清除作用 -中国医药指南2010,8(26)
目的 检测Prousion矿粉对羟基自由基和超氧自由基的清除作用.方法 采用D-脱氧核糖法检测Prousion对羟基自由基的作用,采用黄嘌呤氧化酶法检测对超氧自由基的作用,并采用电子自旋共振(ESR)测定仪分别测定Prousion对这两种氧自由基的作用.结果 研究结果显示,Prousion-A、B、C清除羟基自由基(·OH)的IC50分别为0.2209、0.2962和0.2183g/L,其作用强弱顺序为P-C>P-A>P-B.Prousion-A、B、C清除超氧自由基(O2·)的IC50分别为0.4025、0.3854和0.3626g/L,其作用强弱顺序为P-C>P-B>P-A.ESR测定为这些结果提供了较为一致的佐证.结论 Prousion具有一定的清除氧自由基的作用.
2.期刊论文 赫春香.王杨.曹璨.王世盛.HE Chun-xiang.WANG Yang.CAO Can.WANG Shi-sheng 荧光动力学分析法测定5种(口山)酮清除超氧自由基和羟基自由基的活性 -高师理科学刊2005,25(4)
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本文通过比色法,对数百种中草药进行了筛选,对其中四十种抗氧化性良好的中草药抗羟基自由基和超氧自由基的能力作了测试.甘草、艾叶等抗氧化效果优异.利用正交实验方法研究了艾叶醇-水体系的提取工艺,采用比色法测定其黄酮类和多糖类化合物的含量,发现不同因素对总黄酮和总多糖提取的影响因素依次为:乙醇的浓度>提取温度>提取时间>料液比;并以化学发光法测定出不同提取液抗氧化能力,发现它们均具有优异的抗氧化活性.重点对艾叶中的总黄酮和总多糖进行了分离研究,艾叶中黄酮主要是由5,7-二羟基-6,3′,4′-三甲氧基黄酮、槲皮素、馏分1和馏分4组成;在抗氧化活性中起主要作
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皮肤衰老与自由基有着密切关系.利用邻苯三酚自氧化产生超氧自由基(O-2), Fenton 反应产生羟基自由基(-OH);以比色法测定了一些天然提取物对这二种自由基的清除作用.结果表明;这些提取物大都具有清除作用,其中以芦丁、槲皮素、黄芪总黄酮较强.
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第一，在降解的反应机理方面，反应中是否产生还原性活性粒子超氧自由基；降解反应是以羟基自由基还是以超氧自由基起决定作用；反应发生在重非水相流体DNAPLs(dense non-aqueous phase liquids)的水溶液中，还是可以直接在DNAPLs的非水相降解等问题，目前还存在很大争议。本研究以四氯乙烯(PCE)和三氯乙烯(TCE)为目标有机污染物，采用异丙醇和氯仿分别作为羟基自由基和超氧自由基的俘获剂，来验证降解反应中是否产生超氧自由基以及何种活性粒子起决定作用。
结果发现：在Fenton试剂降解PCE/TCE DNAPLs的反应中，不仅产生羟基自由基，还产生超氧自由基，并以羟基自由基的贡献为主，羟基自由基的产生与否与氧化剂量的多少没有必然联系；采用气相色谱法，分析比较反应30 min时降解反应与挥发溶解实验中PCE剩余量，计算得出，除催化剂与氧化剂浓度皆很低及与PCE的配比很小的情况外，Fenton试剂可以直接降解非水相的PCE。
第二，研究了温度、催化剂浓度、氧化剂浓度对Fenton试剂降解PCE DNAPL的影响，优化了反应条件。
实验表明：
1.同一反应时间时，20、40和60℃的环境温度中，从降解效果和经济上考虑，40℃时为最佳反应温度。
2.在有机物、氧化剂浓度一定时，0.5、5和10 mM催化剂浓度中，5mM催化剂浓度为最佳反应浓度；而在有机物、催化剂浓度一定时，50、100和200mM氧化剂浓度中，100mM氧化剂浓度为最佳反应浓度。浓度过高或过低都不利于降解反应的进行。
第三，首次在反应体系中添加非离子表面活性剂曲拉通(TX100)或阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)，构成表面活性剂-Fenton体系，对PCEDNAPL的降解进行了探讨。
结果发现：
1.添加TX100或SDBS，都能显著促进Fenton试剂对PCE DNAPL的降解效果，且TX100对降解反应的促进性要高于SDBS。
2.表面活性剂的添加量及反应初始浓度与该体系的降解效果成反向关系，在表面活性剂少量且反应初始浓度较低时，该体系的降解效果更好。
3.系统温度在0～60℃时，与非离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系：系统温度在4～38℃时，与阴离子表面活性剂-Fenton体系的降解效果成反比关系。
4.表面活性剂-Fenton体系降解PCE DNAPL的反应中羟基自由基起主要作用，且在降解反应过程中有超氧自由基生成。
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8.学位论文 李加冕 杯芳烃衍生物的合成与性质研究 2006
本文合成了5种杯[4]芳烃下缘修饰的衍生物，其中3种属新化合物。L1和L2属于羧酸类杯[4]芳烃衍生物，已见文献报道，但没有任何相关性质研究。L3、L4、L5属于下缘氮杂杯[4]芳烃衍生物，未见文献报道，特别是L3、L4更属于杯芳冠醚类衍生物。五种化合物都经过熔点、红外光谱、核磁氢谱、元素分析进行了表征。本论文的目的在于研究这五种化合物的体外抗氧化生物活性、自组装作用和对金属离子及有机小分子的分子识别、超分子相互作用的能力。
在体外抗氧化生物活性方面，主要研究了L2～L5四种配体样品的抗超氧阴离子自由基、抗自由基诱导红细胞氧化性溶血和抗羟基自由基的活性。研究抗超氧阴离子自由基的时候，分别采取了固定浓度的配体样品随时间变化清除自由基的实验和不同浓度的配体样品在固定反应时间里清除自由基的实验两种实验方法。分别作出吸光度-时间工作曲线和清除率-样品浓度工作曲线，并拟合工作曲线计算出EC50值。通过研究知道它们都具有很好的清除超氧自由基的能力，并且这种清除能力随样品浓度的增加而不断增强。通过它们清除自由基的速率和EC50值的比较，得出它们清除超氧自由基的能力大小为：L4＞L3＞L2＞L5。研究抗自由基诱导红细胞氧化性溶血的时候，分别采取了不同浓度的同一配体的抑制作用比较和同浓度的不同配体的抑制作用的比较两种比较方法。通过做溶血度-时间工作曲线，可以清楚地知道它们都具有一定的抗氧化性溶血的作用，并且随着样品浓度的增加其活性不断增强。最后得出它们抗氧化性溶血的活性强弱为：L4＞L2＞L3＞L5。研究抗羟基自由基的时候，采用了不同浓度的配体样品对自由基的清除作用的实验方法。通过做清除率-样品浓度工作曲线，拟合出回归方程，从而计算得到EC50值。通过研究知道它们都具有非常好的清除羟基自由基的能力，并且随样品浓度的增加而不断增强。最后通过EC50值的比较得出它们清除羟基自由基的能力为：L5＞L3＞L4＞L2。
在分子识别实验方面，利用荧光光谱法分别研究了L1～L5五种配体对各种各样金属离子的荧光识别作用。发现它们对金属离子的识别是不受金属盐的酸根离子干扰的。通过荧光滴定实验，可以计算出它们对可识别的金属离子的相互作用稳定常数K值，并判断它们的荧光猝灭是静态的还是动态的。与此同时，还通过化学软件hyperchem，优化了L1～L5五种配体的能量最低时采取的结构构型，并且从理论上模拟了L1～L5与它们可以识别的金属离子的配位模式构型，计算了它们配位的单点能，通过单点能的比较，从理论上验证了它们与金属离子相互作用的强弱。L1可以选择性地识别Fe3+、Cr3+、Co2+，K(Fe3+)=1.44×104M-1，K(Cr3+)=3.17×103M-1。L2可以选择性地识别Fe3+、Ce3+、Al3+、Cu2+，K(Fe3+)=7.58×104M-1，(Al3+)=7.10×103M-1，K(Cu2+)=4.47×103M-1,K(Ce3+)=3.08×104M-1。L3可以选择性地识别Fe3+、Cu2+，K(Fe3+)=2.46×104M-1，K(Cu2+)=9.52×103M-1。L4可以选择性地识别Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Ru3+，K(Fe3+)=1.1×106M-1，K(Ru3+)=1.26×104M-1，K(Co2+)=6.79×103M-1，K(Cu2+)=1.17×104M-1。L5可以选择性地识别Fe3+、Cr2+、Cu2+，K(Cu2+)=3.11×104M-1，K(Fe3+)=3.4×104M-1，K(Cr3+)=1.61×104M-1。
在晶体自组装方面，培养了L1和L3的单晶，通过X射线衍射实验研究了L1和L3的晶体结构。主要发现两个配体分子晶体中都存在着CH/π相互作用，而且这种相互作用在形成超分子晶体结构方面起着相当重要的作用。
最后通过目前最新的应用比较少的核磁共振扩散实验，通过测定L1、L3、L5三种主体大分子与各种有机客体小分子在溶液中的扩散系数D的变化，从原子水平研究了它们与有机小分子之间的主客体的超分子作用。并且通过得到的D值，可以方便计算出它们与客体小分子相互作用的稳定常数Ka。通过Ka比较了它们与客体小分子相互作用的强弱。
9.期刊论文 赫春香.张淑敏.周丹红.王杨.王世盛 当药醇甙的伏安行为及其抗氧活性研究 -辽宁师范大学学报(自
羟基和超氧自由基的检测研究进展70_羟基自由基
然科学版)2003,26(2)
研究了当药醇甙的极谱伏安特性及其清除超氧自由基(O-2@)及羟基自由基(@OH)的作用.在磷酸盐缓冲溶液(pH=8.2)中,当药醇甙有一个不可逆吸附还原波,峰电位为-1.61 V(Vs.SCE),有2个电子和2个质子参与了此电极反应.采用经典邻苯三酚自氧化法及Fenton法试验,表明当药醇甙对O-2@及@OH有明显的抑制作用,50%抑制率时当药醇甙的用量分别为12.8和0.22mg@L-1.
10.学位论文 李燕华 黄酮类希夫碱配合物的合成、表征、抗氧化活性以及与DNA结合的研究 2006
本文主要报道了具有生物活性的黄酮类希夫碱及其金属配合物的合成、表征及抗氧化活性和与DNA结合的性质研究。很多黄酮类希夫碱及其配合物具有良好的抗癌性、抗菌性及抗氧化性方面性质，使其在生物学和医药学方面具有重要的意义。基于我们小组研究希夫碱及其配合物在清除超氧自由基和羟基自由基方面的前期工作，本论文设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物，用元素分析、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征，测定其在清除超氧自由基和羟基自由基方面的活性，并研究其与DNA作用方式。
第一章，介绍了希夫碱配合物和黄酮类化合物的发展，对它们的抗氧化活性及与DNA结合等生物活性的原理及进展进行了系统地论述。
第二章中设计合成柚皮素(苯甲酰基)腙(H3L)及其过渡金属配合物，并用元素分析、质谱、摩尔电导、差热分析、红外和核磁共振对其结构进行分析表征。推测配合物的结构MHL·nH2O(M=CuandZn，n=1)和NiH2LOAc·3.5H2O。使用721分光光度计法测定了配体及配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力，并计算其清除率，结果表明，相比较于配体，金属配合物清除超氧自由基和羟基自由基的能力较为强些。
第三章对柚皮素(苯甲酰基)腙及其过渡金属配合物和配体PMBPH及La配合物与小牛胸DNA(ctDNA)的相互作用方式进行了研究。结果表明所研究化合物与ctDNA的作用方式均为插入作用，但金属配合物与ctDNA的结合亲合力明显高于配体。
第四章中设计合成色酮(苯甲酰基)腙及其稀土配合物。由于时间关系，配体和配合物的表征都不完善。
引证文献(1条)
1.熊何健.庞杰.谢主兴 太子参提取物体外抗氧化活性研究[期刊论文]-南开大学学报（自然科学版） 2009(6)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_gpxygpfx200904051.aspx
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五 : 男性不育与Y染色体AZF基因微缺失研究进展
526男性不育与Y染色体AZF基因微缺失研究进展
何劲松 综述 梁季鸿 审校
(广西医科大学第一附属医院男性科,南宁市 530021)
=关键词> 男性不育;Y染色体;AZF基因
=中图分类号> R698.2 =文献标识码> A =文章编号> 0253-4304(2007)04-0526-03 全世界已婚孕龄夫妇存在生育困难的发病率高达10%~15%,男女因素大约各占50%,其中引起男性不育的常见原因有内分泌激素紊乱、生殖道炎症、精索静脉曲张、隐睾、免疫异常、核型异常(克氏征)、性功能障碍(不射精症和逆行射精)等,其中由于遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍约占30%以上[1]。［www.61k.com)除输精管梗阻、腮腺炎病毒感染等明确的病因外,有相当一部分精子发生障碍的男性不育找不出病因,因此有关原发性无精子症及严重少精子症的遗传因素日益受到重视。随着对精子发生的细胞遗传学和分子生物学等领域的深入研究,逐步认识到引起无精症的基因(AZF)位于Y染色体长臂,这一区域的异常和大多数原发性无精子症密切相关。现将AZF基因与男性不育的研究进展综述如下。
段的氨基酸序列与RNA结合家族中的识别基序(Ychromo-someRNArecognitionmoti,fYRRM)具有明显的同源性。YRRM在睾丸内特异性的表达,可分为YRRM1和YRRM2,但仅YRRM1转录活跃。研究表明所有AZFb缺失的男性均未发现RBMY基因的完全缺失,提示RBMY的活性拷贝是不能被去除的[8]。另外CDY(chromodominY)基因也是与精子发生密切相关的基因家族,它包括3个成员,分别为CDY1major、CDY1minor和CDY2。CDY的功能目前还不完全清楚,可能与精子的发生有关。
1.3 AZFc区 AZFc临近异染色质区,估计长度为1.5Mb。在原发性无精子症患者中,AZF基因缺失以AZFc区微缺失较多见。目前已经识别的AZFc基因有:DAZ、PRY、BPY2、TTY2、CDY和RBM,其中DAZ(deletedinazoospermia)基因为最佳候选基因,其为多拷贝基因,称为DAZ家族[9]。DAZ编码的蛋白质与RBMY基因家族编码的蛋白质有相似的结构并在生精细胞中特异表达,表明其可能与RNA的代谢相关。另外DAZ基因只在睾丸表达,表明DAZ基因只参与男性特有的生理过程,也从另一方面支持了DAZ是影响精子生成的重要基因的假设。
1 AZF基因在Y染色体上的分布区域
1976年Tiepolo等[2]在对男性不育患者的染色体核型研
究中发现,6例原发性无精子症患者的Y染色体长臂远端Yq11在显微镜下可见染色体断裂缺失现象,因此提出Y染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因并将其命名为无精子因子(azoospermiafactor,AZF)。1992年Y染色体微缺失图发表,将Y染色体分为7个区(interval),43个亚区(subinterval)。随后在1996年Vogt等[3]将AZF定位于Y染色体长臂远端第5、6区(interval5、6),并将其划分为AZFa、AZFb、AZFc三个区域。此外,有研究人员认为在AZFb和AZFc之间还存在一个AZFd区,但该区是否存在仍有争议[4]。
1.1 AZFa区 AZFa位于Y染色体长臂近侧缺失区interval5内,长度为1~3Mb,该区域已识别的基因有:USP9Y、DBY、UTY、TB4Y,这些基因均与X染色体有同源性并在多种组织中表达,也是与男性不育相关的AZFa候选基因[5]。其中USP9Y是最早发现的AZFa候选基因,也是AZFa最佳候选基因,大小为159Kb,含有46个外显子。对原发性无精症和严重少精症患者进行USP9Y检测时发现USP9Y缺失的病例均表现为原发性无精子症,表明USP9Y的微缺失将导致生精障碍及睾丸发育不良,但其缺失率较低。
1.2 AZFb区 AZFb位于Y染色体长臂缺失区间interval5~6近侧端,长度1~3Mb,至今发现的基因有:CYD、XKRY、RBMY、eIF-1、SMY。AZFb的最佳候选基因是RBMY(RNAbindingmotifYchromosome)家族
[6]
2 AZF基因缺失率及表型
%~55.5% 研究表明,Y染色体AZF微缺失频率为1
[10]
,
之所以缺失频率范围如此大,可能有以下几点原因:(1)研究对象入选的标准不同,可能是无精子症、少精子症和不育症,但精子计数正常以及这几种人群的不同组合。无精和少精只是一个症状,本身就代表不同病因的不均一性。(2)选取STS标记位置的密度及位置不同。(3)病史不清,实验室检查不全面。(4)不同地域、种族间可能存在差异。Voget[3]总结1992~1996年发表的19篇文献,AZF缺失平均发生率为10.2%,其中比较高者均为原因不明性不育。Oliva等[10]在186例不育者中发现Y染色体微缺失10例(5.4%)、无精子者占16%(8/50),少精子占1.5%(2/136);在以Sertoli细胞综合征为筛查对象的研究中,微缺失率高达55.5%,AZFa、AZFb、AZFc三个区域均有微缺失现象发生[11]。谭超等[12]对成都地区42例原发性男性不育症患者AZF基因研究表明微缺失的总体发生率为19.1%,AZFc区缺失要比AZFa及AZFb区缺失区更常见,分别占缺失的47.6%、11.9%及23.8%。Forsesta等[13]在对男性不育症患者Y染色体分析时发现无精子症患者的AZFc基因缺失率最高,缺失的区域以AZFc的
,是1993年英国学者Ma
等[7]首次分离和克隆定位于Y染色体长臂的DNA片段,该片
azf 男性不育与Y染色体AZF基因微缺失研究进展
广西医学 2007年4月第29卷第4期
DAZ家族最多见,提示AZFc区的缺失是整个AZF缺失区域的热区,可将此基因片段缺失作为无精子和严重少精子症病因筛选的主要候选基因。［www.61k.com）
到目前为止严格的基因型和表型的关系尚不清楚,Kent-First等[14]的研究表明Y染色体微缺失基因型和表型有大致如下的关系:AZFa缺失者75%的病理表现为Sertoli细胞综合征(SCOS)?型(只有支持细胞而无精原细胞),另有少部分表现为精子生成受抑而表现为严重少精子症;AZFb基因全部缺失常与生精阻滞有关,病理通常表现为精子发生停留在精母细胞或精子细胞阶段,AZFb基因部分缺失或同时伴有AZFa或AZFb缺失时,患者的临床表现成多样化[15],包括唯支持细胞综合征、无精子症或少精子症、AZFc缺失者精子计数从无到正常但伴有精子形态异常,睾丸活检的病理表现为与ò型唯支持细胞综合征相关既一些精原细胞呈现,并有有限的精子生成或精子生成减少。
527
行种植前遗传学诊断切断遗传途径,一种方法是选女胚移植,另一种方法是对生殖细胞嵌合体的男性也可以选择正常男胚移植。(2)诊断Y染色体微缺失,找到精子生成障碍的真正原因,从而避免不必要的药物及手术治疗。(3)诊断无精子症患者Y染色体微缺失的种类,现研究表明AZFb缺失者不能找到精子,而AZFc缺失者75%可活检到成熟精子,故对睾丸活检能否发现成熟精子有一定的指导意义[19,20]。(4)由于AZFc缺失可能出现随时间进行性精子数量减少的现象[21],所以携带AZF缺失的少精症或无精症的父亲如能通过ICSI或IVF技术受孕,其男性后代在成年早期也应考虑精液的保存,避免将来不必要的治疗。尽管父亲可将这种Y染色体微缺失遗传给儿子,但后代的遗传表型可能有所不同,还不能完全预测其不育的程度。
4 结 语
在我国,随着近年来男性原发性不育患者的就诊率的不
断升高和辅助生殖技术规模的不断扩大,开展AZF的检测在临床工作中显得越来越重要。在行AZF检测前应排除以下引起不育的因素:生殖道的感染、梗阻性无精子症、精索静脉重度曲张、内分泌激素的异常、免疫性不育、染色体的核型异常(克氏征)及隐睾等先天性发育异常引起的不育症。随着研究的不断深入,AZF基因的研究可能会向以下几个发展方向:(1)进一步明确基因型与表型的关系,为临床的诊断和治疗提供依据。(2)对AZF基因缺失是否存在地域及种族差异进行深入的研究。(3)目前的研究集中在微缺失特征及基因的发现,对Y染色体基因编码的蛋白质知之甚少,而其重要的部分可能涉及到RNA代谢和加工的过程,这是生殖细胞分化的一个重要方面。(4)规范和统一临床检测的标准,为诊断和治疗提供依据。
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3 AZF基因缺失的检测及其意义
目前,针对AZF基因缺失的检测主要采用Y染色体特异
性序列标签位点(sequence-taggedsites,STS)引物行PCR扩增,检测光镜下分辨不出来的Y染色体微缺失。作为基因物理图谱的STS是一段已知核苷酸序列的DNA片段,可真实反映染色体上不同的基因序列,诊断Y染色体微缺失的基因诊断策略是设计引物对AZFa、AZFb、AZFc3个区域进行缺失筛查,每个区域选择2~3个STS位点进行PCR扩增,既在同一PCR反应体系中加入数对AZF区域STS引物,如果这些引物的退火温度相近并且所覆盖的区域不重叠,就可以同时扩增一分DNA样品中不同基因位点的不同序列,AZF基因的某一片段则相应的电泳图谱上这一区带就会消失,一旦发现缺失,单独扩增缺失位点以确认
[16]
。不同的研究者进行Y染色体
AZF缺失分析时选用的STS数目有很大的差异,从5~118个不等,检测时应用多少个Y染色体特异性STS位点及其代表性国际上尚存争议,缺乏统一的标准,但将AZF分为AZFa、AZFb、AZFc3个区域已被大部分的研究者所接受。1999年Simoni等
[17]
在总结大量AZF微缺失分子流行病学调查资料
的基础上,提出了欧洲标准化的临床AZF微缺失筛查方案,该方案用sY84、sY86代表AZFa基因,sY127、sY134代表AZFb基因,sY254、sY255代表AZFc基因,对原发性无精子症及重度少精子症进行筛查,进一步推动了AZF区域微缺失检测的临床应用。
随着辅助生殖技术的进步,使越来越多的无精及少精症患者有了生育的希望。目前,对无精、少精患者生育的有效治疗是单精子卵泡内注射(intracytoplasmicsperminjection,ISCI)、ISCI+睾丸精子穿刺或经皮穿刺附睾抽吸取精术,尽管带有Y染色体微缺失的精子其受精率与正常的精子相比有否差别存在一些矛盾的结果
[18]
,但对这些病人可能存在的遗传
学问题的解决是至关重要的。所以对这一群体的遗传学咨询及筛查是十分必要的:(1)无精子和少精子存在的遗传学问题如Y染色体微缺失可垂直传给男性后代,可通过术前筛查进
azf 男性不育与Y染色体AZF基因微缺失研究进展
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(收稿日期:2006-12-28 修回日期:2007-01-31)
转基因植物疫苗的研究进展
黄大林 综述 陈森洲 审校
(桂林医学院微生物学与免疫学教研室,桂林市 541004)
=关键词> 转基因植物;疫苗
=中图分类号> R979.5 =文献标识码> A =文章编号> 0253-4304(2007)04-0528-03 疫苗一直是人类用于防治人和动物疾病的有力武器。（www.61k.com)随着各种疫苗的出现,曾经在地球上猖狂一时的某些感染性疾病已得到基本控制。但是,对广大发展中国家来说,在疫苗的研制、生产和使用等诸多环节面前,存在一道难以逾越的经济屏障。据统计,在全球范围内每年有20%的儿童死于无法接种百日咳、破伤风、麻疹、脊髓灰质炎和结核分支杆菌疫苗,在贫困落后地区尤为严重。因此,在这些国家和地区,利用一种新的生物技术生产廉价的疫苗势在必行。
细菌、酵母及哺乳动物细胞等是基因工程疫苗的主要表达系统。为了生产更加安全、有效、廉价、易于推广应用的疫苗,科学家们在努力寻找新的表达系统。用转基因植物生产的疫苗具有独特的优势及可观的应用前景。1989年美国科学家在烟草、马铃薯等植物上成功地制造了乙肝疫苗、大肠埃希菌疫苗,用这些植物喂饲小鼠后,均产生了预防接种的效果。这是近年来提出的/分子农业0、/植物工厂0具有诱惑力的部分[1,2],也是当前国际上植物基因工程研究的一个新趋势,引起了植物学、微生物学、免疫学、分子生物学等方面的专家极
大兴趣和关注。自第1例转基因植物表达系统生产疫苗在国际专利合作公约上出现以来,很多植物疫苗已问世,并在动物、人体内进行了临床研究。结果表明,植物疫苗在预防感染性疾病、治疗肿瘤和自身免疫病等方面是可行有效的。
1 转基因植物疫苗生产的一般流程
转基因植物疫苗生产的一般流程如下:1克隆特异性抗
原的编码基因;o将目的基因插入植物表达载体上或植物病
毒载体上[3,4]。稳定的整合表达系统将目的抗原的编码基因构建于植物表达载体上,通过农杆菌或基因枪介导的方法将抗原基因导入到植物细胞并整合到植物基因组中,获得能稳定表达目的抗原的转基因植株。这种性状可遗传给子代,形成表达疫苗的新植物品系。目前研究成功的植物疫苗主要使用的是这种系统,外源基因可插入到植物核基因组或叶绿体基因组。同病毒载体相比,其可插入的外源基因大小几乎不受限制,大到50kb的外源DNA也能被顺利包装与转移,而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。一系列的动物实验已证明,用这种表达系
本文标题：功能基因组学研究进展-银行跨界重组基因：小学生善融资撞进电商丛林61阅读| 精彩专题| 最新文章| 热门文章| 苏ICP备13036349号-1