一 : 荧光光谱分析
一、实验目的与要求：
1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用；
2. 掌握荧光分光光度计的工作原理；
3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。
。www.61k.com”二、基本概念
1. 发射光谱
是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。
发射光谱常分为带谱和线谱 ，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。
2. 激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。
3. 余辉衰减曲线
是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。
三、测试仪器
激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。
从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器 照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。
注意：选做钨灯光源激发光谱、发射光谱测试的同学应采用天津港东WGY-10型荧光分光光度计。
光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后 发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。
四、样品制备
1. 粉末试样
粉末试样可适当添加不影响光谱特性的粘结剂（也可不添加粘结剂），置于样品台凹槽中，压实、用载玻片碾平，固定到样品座中。
2. 块状试样
块状试样可以直接用双面胶粘结在样品台上，固定到样品座中。
3. 液体试样
液体试样应放入专用的液体样品槽中，固定到样品座中。
五、测试过程
（一）RF-5301PC荧光分光光度计测试发射、激发光谱及余辉衰减曲线步骤
先开机：打开Xe灯开关 和 主机开关。开电脑。双击 电脑桌面的 “RFPC”程序快捷键 进入测试程序，会出现 初始化界面，仪器依次检测ROM、RAM、EEPROM激
发狭缝、发射狭缝、激发单色器、发射单色器和基线，初始化完成后，进入到测试界面。
1. 发射光谱的测试
第一步：参数设置。
点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：
(1) 第一行为光谱类型。选择“Emission”发射光谱
(2) 第二行为激发波长。输入激发波长
(3) 第三行为发光波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长（对于未知样，也可选择可见光全波段400~760nm）
(4) 第四行为记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值
(5) 第五行为扫描速度。由快至慢有6种速度选择
(6) 第七行为狭缝宽度。可分别选择 激发和发射狭缝 宽度，对于发光较弱的样品，测试时可以适当增大狭缝宽度。
(7) 第八行为测试灵敏度选框。
(8) 第九行为响应时间选框，由快至慢有9种速度选择
(9) 参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：光谱测试。
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始发射光谱测试。测试完成后，屏幕会自动弹出一个保存界面：上栏可输入文件名称，下栏可输入注解，若输入注解，则该注解将会在打印出的报告中显示出来。输入文件名后，点击“Save”保存。
注意：这种保存只是临时保存，关机后将消失。永久保存需使用 File / Save as，选择存储路径和文件夹，点击“Save As”保存。保存后的文件，扩展名是“.SPC”，只能用“RF-5301PC”程序打开。若想将测试结果转换为数据，以利于使用其他软件作图和编辑，需进行数据转换。
第三步：自动寻峰。
对于测试所得的发射光谱，程序能够进行自动寻峰。
步骤是：点击Manipulate 操作 / 选择Peak pick / 鼠标左键点住屏幕下方弹出的窗口，上拉，调整窗口大小，即可读出峰值。
第四步：数据转换。
点击File / Data translation / AscII Export / 则询问转换哪个通道？选择通道后，点击OK，则数据转换过程完成。
转换后的扩展名为“.ASC”的文件自动保存在了C盘 / RFPC 文件夹 / Data 子夹中。
第五步：数据处理。
打开Origin软件，点击工具菜单中的 “导入ASC码文件” 快捷键，按照路径 寻找 我们刚刚转换的 扩展名为“.ASC” 的文件，点击“打开”，则数据被导入。
点击屏幕下方的“直线”工具，即可完成作图。调整 横、纵坐标的字号。输入 横、纵坐标名称和单位。数据处理完成后，可直接复制到Word文件中。
2. 激发光谱的测试
第一步：参数设置。
点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：
(1) 在光谱类型选框中，选择“Excitation”激发光谱，选择后，下面几行选项随之变化。
(2) 第二行为监测的发光波长。通常，选择发射光谱的峰值位置作为监测波长。
(3) 第三行为激发波长范围。
输入扫描的起始波长和终止波长（通常终止波长应小于发射光谱的短波边，但允许有适量交叉）
(4) 以下“记录范围”、“扫描速度”、“狭缝宽度”、“灵敏度”及“响应时间”的设置，与发射光谱测试时的设置相类似。
(5) 参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：光谱测试。
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始激发光谱测试。测试完成后，自动寻峰、数据转换、数据处理的操作与发射光谱相类似。
3. 余辉衰减曲线的测试
第一步：参数设置。
点击“Acquire Mode”，在下拉菜单中选择“Time Course”模式，进行测试参数设置。其中，参数设置对话框上半部分：激发波长、监测发光波长、狭缝宽度、灵敏度、响应时间及记录范围的设置与发射光谱、激发光谱测试时的设置相类似。参数设置对话框下半部分：反应时间是指余辉衰减曲线的测试时间，即横坐标的扫描时间段；时间模式可选自动或手动；时间单位默认为秒。参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：余辉衰减曲线测试
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始余辉衰减曲线的测试。测试完成后，数据转换、数据处理的操作与发射光谱及激发光谱的操作相类似。
（二）WGY-10荧光分光光度计测试钨灯光源发射光谱和激发光谱实验步骤
先开机：开钨灯，开风扇、开电脑。双击 电脑桌面的“WGY-10荧光分光光度计”程序快捷键 进入测试程序，会出现初始化界面，依次出现“激发光栅检零”、“激发光栅检索为起始波长”、“激发狭缝初始化”、“激发滤光片初始化”、“发射光栅初始化”、“发射光栅检索为起始波长”、“发射狭缝初始化”和“发射滤光片初始化”，初始化完成后，进入到测试界面。
1. 红外光激发条件下发射光谱的测试
第一步：参数设置。
在屏幕下方“方式设置”部分：工作模式选框，测发射光谱时选择发射扫描； “扫描设置”部分：在起始波长和终止波长选框，输入扫描起始波长和终止波长；扫描间隔，即采样时间间隔，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0nm六种选择（注意扫描间隔增大，曲线平滑度会相应降低）。激发狭缝和发射狭缝有2、4、6、8、10、20nm六种选择。负高压，取值范围为1~256，其数值大小 决定 光谱纵坐标信号的强弱（对于未知样，测试时可先将负高压设为100，然后再视具体测试情况调整负高压）。
第二步：输入激发波长
点击“激发”工具，输入激发波长，激发波长的可选范围为760~1600nm，比如输入1100nm。点击确定后，仪器会自动检索激发波长，检索完成后，屏幕下方“即时数据”部分的激发波长显示为设定的波长。
第三步：光谱测试
点击“
单程”工具，屏幕会弹出对话框，询问 测试结果 存入哪条通道。选择通道后，点击“确定”，光谱测试开始。时间大约持续1分钟。
第四步：数据保存。
点击“保存”按钮，在弹出的对话框中 选择 要保存的通道 及 数据保存类型，点击“确定”，选择数据存储路径后，点击“保存”。
保存成功后，数据以扩展名为“.yz”和“.txt”的两个文件并存。其中扩展名为“.yz”的文件只能用 测试程序打开，扩展名为“.txt”的文件 则可使用Origin软件的“导入ASC码文件”快捷键导入，进行作图和数据处理。
2. 红外光激发条件下激发光谱的测试
第一步：参数设置。
工作模式选择激发扫描；扫描设置，输入扫描的起始波长和终止波长（仪器默认的起始波长为760nm，终止波长为1600nm）；选择扫描间隔；选择激发狭缝、发射狭缝和负高压。
第二步：输入监测波长
点击“发射”工具，输入 监测的发光波长。点击确定后，仪器会 自动检索发射波长，检索完成后，屏幕下方 “即时数据”部分的发射波长显示为选定的波长。
第三步：光谱测试
点击“单程”工具，屏幕弹出对话框，选择通道，点击“确定”，光谱测试开始。
第四步：数据保存。
点击“保存”按钮，选择通道及数据保存类型，点击“确定”，选择数据存储路径，点击“保存”。保存成功后，扩展名为“.txt”的文件可使用Origin软件导入，进行作图和数据处理。
六、实验报告要求
(1) 应包括实验目的、实验原理，样品制备方法及测试步骤。
(2) 要求附上测试光谱，注明测试时的具体参数，并对光谱进行简单分析。
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一、实验目的与要求：1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用；
2. 掌握荧光分光光度计的工作原理；
3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。
二、基本概念
1. 发射光谱
是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。
发射光谱常分为带谱和线谱 ，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。
2. 激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。
3. 余辉衰减曲线
是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。
三、测试仪器
激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。
从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器 照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。
注意：选做钨灯光源激发光谱、发射光谱测试的同学应采用天津港东WGY-10型荧光分光光度计。
光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后 发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。
四、样品制备
1. 粉末试样
粉末试样可适当添加不影响光谱特性的粘结剂（也可不添加粘结剂），置于样品台凹槽中，压实、用载玻片碾平，固定到样品座中。
2. 块状试样
块状试样可以直接用双面胶粘结在样品台上，固定到样品座中。
3. 液体试样
液体试样应放入专用的液体样品槽中，固定到样品座中。
五、测试过程
（一）RF-5301PC荧光分光光度计测试发射、激发光谱及余辉衰减曲线步骤
先开机：打开Xe灯开关 和 主机开关。开电脑。双击 电脑桌面的 “RFPC”程序快捷键 进入测试程序，会出现 初始化界面，仪器依次检测ROM、RAM、EEPROM激
发狭缝、发射狭缝、激发单色器、发射单色器和基线，初始化完成后，进入到测试界面。
1. 发射光谱的测试
第一步：参数设置。
点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：
(1) 第一行为光谱类型。选择“Emission”发射光谱
(2) 第二行为激发波长。输入激发波长
(3) 第三行为发光波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长（对于未知样，也可选择可见光全波段400~760nm）
(4) 第四行为记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值
(5) 第五行为扫描速度。由快至慢有6种速度选择
(6) 第七行为狭缝宽度。可分别选择 激发和发射狭缝 宽度，对于发光较弱的样品，测试时可以适当增大狭缝宽度。
(7) 第八行为测试灵敏度选框。
(8) 第九行为响应时间选框，由快至慢有9种速度选择
(9) 参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：光谱测试。
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始发射光谱测试。测试完成后，屏幕会自动弹出一个保存界面：上栏可输入文件名称，下栏可输入注解，若输入注解，则该注解将会在打印出的报告中显示出来。输入文件名后，点击“Save”保存。
注意：这种保存只是临时保存，关机后将消失。永久保存需使用 File / Save as，选择存储路径和文件夹，点击“Save As”保存。保存后的文件，扩展名是“.SPC”，只能用“RF-5301PC”程序打开。若想将测试结果转换为数据，以利于使用其他软件作图和编辑，需进行数据转换。
第三步：自动寻峰。
对于测试所得的发射光谱，程序能够进行自动寻峰。
步骤是：点击Manipulate 操作 / 选择Peak pick / 鼠标左键点住屏幕下方弹出的窗口，上拉，调整窗口大小，即可读出峰值。
第四步：数据转换。
点击File / Data translation / AscII Export / 则询问转换哪个通道？选择通道后，点击OK，则数据转换过程完成。
转换后的扩展名为“.ASC”的文件自动保存在了C盘 / RFPC 文件夹 / Data 子夹中。
第五步：数据处理。
打开Origin软件，点击工具菜单中的 “导入ASC码文件” 快捷键，按照路径 寻找 我们刚刚转换的 扩展名为“.ASC” 的文件，点击“打开”，则数据被导入。
点击屏幕下方的“直线”工具，即可完成作图。调整 横、纵坐标的字号。输入 横、纵坐标名称和单位。数据处理完成后，可直接复制到Word文件中。
2. 激发光谱的测试
第一步：参数设置。
点击Configure 设置 / Parameter 参数，进行测试参数设置：
(1) 在光谱类型选框中，选择“Excitation”激发光谱，选择后，下面几行选项随之变化。
(2) 第二行为监测的发光波长。通常，选择发射光谱的峰值位置作为监测波长。
(3) 第三行为激发波长范围。
输入扫描的起始波长和终止波长（通常终止波长应小于发射光谱的短波边，但允许有适量交叉）
(4) 以下“记录范围”、“扫描速度”、“狭缝宽度”、“灵敏度”及“响应时间”的设置，与发射光谱测试时的设置相类似。
(5) 参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：光谱测试。
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始激发光谱测试。测试完成后，自动寻峰、数据转换、数据处理的操作与发射光谱相类似。
3. 余辉衰减曲线的测试
第一步：参数设置。
点击“Acquire Mode”，在下拉菜单中选择“Time Course”模式，进行测试参数设置。其中，参数设置对话框上半部分：激发波长、监测发光波长、狭缝宽度、灵敏度、响应时间及记录范围的设置与发射光谱、激发光谱测试时的设置相类似。参数设置对话框下半部分：反应时间是指余辉衰减曲线的测试时间，即横坐标的扫描时间段；时间模式可选自动或手动；时间单位默认为秒。参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：余辉衰减曲线测试
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始余辉衰减曲线的测试。测试完成后，数据转换、数据处理的操作与发射光谱及激发光谱的操作相类似。
（二）WGY-10荧光分光光度计测试钨灯光源发射光谱和激发光谱实验步骤
先开机：开钨灯，开风扇、开电脑。双击 电脑桌面的“WGY-10荧光分光光度计”程序快捷键 进入测试程序，会出现初始化界面，依次出现“激发光栅检零”、“激发光栅检索为起始波长”、“激发狭缝初始化”、“激发滤光片初始化”、“发射光栅初始化”、“发射光栅检索为起始波长”、“发射狭缝初始化”和“发射滤光片初始化”，初始化完成后，进入到测试界面。
1. 红外光激发条件下发射光谱的测试
第一步：参数设置。
在屏幕下方“方式设置”部分：工作模式选框，测发射光谱时选择发射扫描； “扫描设置”部分：在起始波长和终止波长选框，输入扫描起始波长和终止波长；扫描间隔，即采样时间间隔，有0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0nm六种选择（注意扫描间隔增大，曲线平滑度会相应降低）。激发狭缝和发射狭缝有2、4、6、8、10、20nm六种选择。负高压，取值范围为1~256，其数值大小 决定 光谱纵坐标信号的强弱（对于未知样，测试时可先将负高压设为100，然后再视具体测试情况调整负高压）。
第二步：输入激发波长
点击“激发”工具，输入激发波长，激发波长的可选范围为760~1600nm，比如输入1100nm。点击确定后，仪器会自动检索激发波长，检索完成后，屏幕下方“即时数据”部分的激发波长显示为设定的波长。
第三步：光谱测试
点击“
单程”工具，屏幕会弹出对话框，询问 测试结果 存入哪条通道。选择通道后，点击“确定”，光谱测试开始。时间大约持续1分钟。
第四步：数据保存。
点击“保存”按钮，在弹出的对话框中 选择 要保存的通道 及 数据保存类型，点击“确定”，选择数据存储路径后，点击“保存”。
保存成功后，数据以扩展名为“.yz”和“.txt”的两个文件并存。其中扩展名为“.yz”的文件只能用 测试程序打开，扩展名为“.txt”的文件 则可使用Origin软件的“导入ASC码文件”快捷键导入，进行作图和数据处理。
2. 红外光激发条件下激发光谱的测试
第一步：参数设置。
工作模式选择激发扫描；扫描设置，输入扫描的起始波长和终止波长（仪器默认的起始波长为760nm，终止波长为1600nm）；选择扫描间隔；选择激发狭缝、发射狭缝和负高压。
第二步：输入监测波长
点击“发射”工具，输入 监测的发光波长。点击确定后，仪器会 自动检索发射波长，检索完成后，屏幕下方 “即时数据”部分的发射波长显示为选定的波长。
第三步：光谱测试
点击“单程”工具，屏幕弹出对话框，选择通道，点击“确定”，光谱测试开始。
第四步：数据保存。
点击“保存”按钮，选择通道及数据保存类型，点击“确定”，选择数据存储路径，点击“保存”。保存成功后，扩展名为“.txt”的文件可使用Origin软件导入，进行作图和数据处理。
六、实验报告要求
(1) 应包括实验目的、实验原理，样品制备方法及测试步骤。
(2) 要求附上测试光谱，注明测试时的具体参数，并对光谱进行简单分析。
荧光光谱分析
一、实验目的
1、了解荧光光谱的基本原理；
2、熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程；
3、了解荧光光谱的基本分析方法。
二、 荧光光谱原理
分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光(phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。
2.1、荧光及磷光的产生原理
含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生ππ* 和nπ* 电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。
在图11-1电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11-1可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196oC）才可以发射。
2.2 荧光强度与浓度的关系
由荧光发生机理可知，荧光强度If由下式表示；
If=φf ·Ia
式中：Ia为被荧光物质吸收了的光强；φf为荧光量子效率，φf＝发射荧光的分子数／激发的分子总数，亦称荧光量子产率。根据光的吸收定律，被吸收光的强度Ia为
Ia=Io-It=Io(1-It/Io)
If=φf ·Io(1-eεbc) （11-2）
式中：Io---激发光的光强
It―透过光强度
ε－摩尔吸收系数
b－样品槽长度
c－样品浓度。
若Io固定，则If取决于式子（11-2）中的指数衰减项。将其指数项用级数展开得：
由于荧光分析中检测物质浓度c很稀，方程(11-3)可写成：
If＝φf ·Ioεbc (11-4)
当工作条件一定时，式(11—4)中Io ε b 都为常数，则
If=kφfc
对于某种被分析物质及溶剂，φf也是常数，则
If=K c
此式为荧光定量分析的依据。
2.3 荧光、磷光与分子结构的关系
一、影响荧光、磷光强度的因素
分子发光过程可由图11-5所示，可由分子激发态的各
种辐射过程的速率常数来讨论影响发光的因素。图中S，S*
和T分别表示基态、最低受激单重态和三重态。kc和kc'
分别是受激单重态和三重态无辐射去激发过程的速率常
数；kf和kp分别表示荧光和磷光发射过程的速率常数。kx
为最低s*-T态无辐射过程速率常数。这样，荧光量子效率
为：
φf =kf
kfkckx (11-9)
若kc和kx远大于kf, 则φf将趋于0；显然，凡是能使
kf值升高得因素均可增强荧光。
磷光量子效率取决于kx、kp、kc’, 可由下式表示：
一般来讲，kf和kp主要取决于分子结构，而受工作环境影响极小；而kc和kc'则受发光环境的强烈影响；kx既受分子结构的影响，也在一定程度上受环境的影响。分子中S*－T态间的能量差ΔE影响着kx, ΔE越小，则kx越大，有利于激发态之间的转化，φP大，有利于磷光发射。
在实际工作中，荧光分子或磷光分子与溶剂分子及其它溶质分子相互作用，引起荧光强度或磷光强度降低的现象称为荧光熄灭或磷光熄灭现象。引起这种现象的一些物质叫熄灭剂。这种熄灭效应是由发光分子受环境作用而产生的。其原因很多，机理也很复杂。但主要是S*，T态发光分子与熄灭剂发生碰撞，由于碰撞作用使无辐射去激发速率kc和kc'变大，因而产生熄灭现象. 显然，碰撞熄灭观象与温度、溶剂的粘度有关系。不难理解，升高温度，降低粘度，都将使发光熄灭作用增大。因此，低温磷光就是基于这一原理建立起来的。
二、分子发光与结构的关系
如果要使分子能够产生荧光或磷光，首先要求分子能够吸收紫外或可见光辐射能。根据吸收定律，εmax大的物质，吸光度A也大，A又影响kf和kp,因此，εmax可以作为荧光、磷光发射的定性量度。通常分子吸收辐射能力越强，产生的荧光或磷光也越强。能够强烈发光的分子几乎都是通过ππ* 跃迁去激发产生的辐射。一船来讲，具有共轭双键、刚性较强的平面结构和多环结构分子易产生荧光；含杂环的芳香烃产生的磷光比荧光强。
取代基对分子发光有明显的影响，一般有以下一些规律：
(1)给电子的基团常使荧光增强，因为这类基团使最低激发
单重态和基态间的跃迁几率增大。例如，－NH2，-OH，-OR等。
(2)吸电子的基团会使荧光减弱，因为此类基团使最低激发
单重态和基态间的跃迁几率减小，即使kf减小。例如，COOH，-NO2，-N=N-，-SH及卤素等。
(3)引入原子序数较大的原子到 π电子体系中，可使磷光增强，而荧光减弱，这种现象称为重原子效应。如卤素取代基随原子序数增加，使荧光减弱，磷光增强。这是由于在重原子中能级之间的交叉现象更严重，使单重态S*到三重态T的无辐射速率常数kx增大。类似同样的原因，发光分子在含有重原子的溶剂如碘乙烷、溴乙烷中或在含有重原子的Ag+盐、Pb2+盐、Tl+盐中，荧光减弱，磷光会增强。
另外，环的封闭作用，有机螯合剂与金属离子形成配位键以及有机试剂与金属离子生成内络盐等，都可使发光分子结构的刚性增强，使kc减小，kf增大，故有利于荧光的产生。
三、荧光和磷光分析法的应用
在荧光和磷光分析法中，由于测定的是If和Ip故可通过增强Io来提高灵敏度。一般来讲，它们的灵敏度比分子吸收光谱法高10-103倍。磷光分析法因不存在散射光干扰问题，可使用较宽的狭缝以增大Io，所以灵敏度比荧光法还要高。
由于分子荧光分析法的选择性和灵敏度好，常应用于医药、食品、生物化学和天然产物的分析。在有机物分析方面应用轻多。荧光分析法在以上领域中具有特殊的作用。
一般说来，无机离子不发射荧光，但许多金属离子可与有机试剂形成荧光配合物，从而可以利用荧光分析法进行定量分析。目前已有60余种元素可用荧光分析法测定。某些阴离子如F-，CN-等，可利用对其荧光物质的熄灭效应，来测定它们的浓度，这类方法称间接荧光分析法。
分子磷光分析法主要用于生物体液中痕量药物的分析。例如，血中色氨酸、含硫药物、阿司匹灵、咖啡因，血清中的普鲁卡因、柯卡因、苯巴比妥和阿托平等分析。
出于磷光物质比荧光物质更少，并且磷光分析法必须在低温度下进行，应用上受到一定限制；但对于那些在室温下不发生荧光或只发生微弱荧光，而在低温下可产生磷光的物质，
磷光分析将发挥作用。
三、荧光光谱仪原理
用于测量荧光的仪器种类较多，但它们的构造原理基本相同。荧光分光光度计的光学系统如图11—2所示。由于氙灯在250～600nm光谱区有很强的连续辐射，故商品仪器中常用氙灯为荧光激发源。采用双单色仪（常用光栅），一个是激发用单色仪，其作用是获得单色性较好的激发光以激发样品产生荧光；另一个是荧光用单色仪，其作用在于减少光谱干扰，得到一定波长的荧光。为了防止光源对荧光测定的干扰，光源与检测器不在一条直线上。一般所说的荧光光谱实际上是指荧光发射光谱，即是将激发用单色仪波长固定，荧光用单色仪进行波长扫描所得到的荧光强度随荧光波长变化的曲线。
荧光光谱与其共振吸收光谱常呈镜像对称关系。蒽的共振吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱如图11-3所示。葱的荧光光谱和共振吸收光谱呈明显的镜像对称关系。
四、操作规程和注意事项
4.1 RF-5301PC荧光光谱仪操作规程
1．连接荧光光谱仪数据传输线至计算机上。取出样品室中的干燥剂，开荧光光谱仪。
2．开计算机，调出RF-5301PC程序，开始自检。若有某项自检未通过，则关机重新自检。
3．若为第一次使用或更换Xe灯后，需调整灯的位置（非专业人士一般不要自行换灯，详
见使用手册）。
4．调整参数。
5．在样品仓中倒入蒸馏水，关样品室，按计算机屏幕上Go To WL按钮，选择450nm散射
波长做基线校准此步骤并非必须，原则上仪器调好后不必每次校准）。
6．按Auto zero按钮，归零。
7．取出样品仓，放入待测样品，关样品室。
8．按计算机屏幕上按start钮，开始测试。
9．测试完毕后按照计算机提示输入样品名称，保存。
10. 取出样品,放入下一个样品重复7--9操作；若不再测试取出样品，进入关机操作（见下）。
11. 关RF-5301PC程序，关计算机。
12. 关荧光光谱仪，把干燥剂放进样品仓。
4.2 RF-5301PC荧光光谱仪操作规程使用环境及注意事项
使用环境：室温：15ºC-35ºC。
1. 避免太阳光直接照射。
2. 避免强烈震动或持续震动。
3. 室内相对湿度：45%-80%（若室温高于30ºC，相对湿度应70%）。
4. 远离磁场，电场。
5. 远离腐蚀性气体及在紫外区可吸收的有机，无机气体。
6. 保持室内环境清洁卫生。
注意事项：
1. 注意光谱仪上灯电源接口处高压，以防触电。
2. 更换保险时，应关掉电源并拔掉电源插头，以防触电。
3. 荧光光谱仪，紫外可见光谱仪上灯亮时，灯源周围高温，禁止触摸，以防被烫伤。
4. 应严格按操作规程操作。
五、思考题
1．阐述分子荧光的产生原理？
2．为什么分子荧光、磷光分析法的灵敏度一般比分子吸收光谱分析法高？
第五章 荧光分析法第五章 荧光荧光分析法
荧光分析法的基本原理第一节第一节
荧光定量分析方法第二节第二节 荧光定量分析方法 荧光分光光度计第三节第三节 荧光分光光度计
分子荧光分析的特点：
1.灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至10-12 g/ml。
2.选择性好3.线性范围宽4.应用范围窄
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence molecular fluorescence
1. 分子荧光的产生
★分子能级比原子能级复杂
每个电子能级上都存在振动、转动能层★在分子体系中，分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能每个电子能级上都存在振动、转动能层★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态,用符号S0表示
小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 激发态：一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激激发态→
发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态； 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；
小结：激发单重态与激发三重态的不同
�激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的
而激发三重态 �激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），），而激发三重态
s）的长（10-4~10~10s
�基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁；
S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；
辐射和非辐射能量传递过程辐射和非辐射能量传递过程
电子能级中，以热能量交换形式由高振动能振动弛豫：同一同一电子能级中，以
层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。发生振动弛豫的时间10内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
→基态荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能层第一激发单重态的最低振动能层→
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 λ3的荧光，10-7~10-9s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长： λ3>λ 2>λ 1 ；
外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1→ S0
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的非辐射跃迁。
禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1→T1 就可发生系间跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1
s、磷光的能量比荧光小→S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4~100~100s
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 S0→激发激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→
光照停止后，可持续一段时间
2. 荧光的激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum荧光分子都具有两个特征光谱：
激发光谱和发射光谱（荧光光
谱）。
（1）荧光的激发光谱
激发光谱：表示不同激发波长
下所引起物质发射某一波长荧光的
相对效率。
绘制激发光谱：固定发射波长固定发射发射波长
(选最大发射波长),然后以不同波长的选最大发射波长),),然后以不同波长的
入射光激发荧光物质，以荧光强度F对
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长 λex
（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时， 使激发光波长固定在λex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F 对发射波长λ作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。
发射光谱（荧光光谱）的位置？
磷光光谱的位置？
激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移
荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波 荧光光谱总是位于物质激发光谱的长波一侧，即荧光波长大于激发光波长的现象。
： 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值：
振动弛豫、内转换等物辐射跃迁损失了部分能量。 b. 荧光光谱的形状与激发波长无关
电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图λ 2 、λ 1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如λ 3 。
镜像规则c. 镜像规则
由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常 由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，
荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。
各小峰波长
递减值与振
动能级差有
关，各小峰
的高度与跃
迁几率有关。
基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各能级分布类似；
基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能 基态上的某振动能级若跃迁到第一激发态的某振动能级的几率较大的话，相反跃迁也如此。
三、影响荧光强度的因素
relation between fluorescence and molecular structure
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，π→π*跃迁所需的能量差△E所增强。这是因为在极性溶剂中，π
小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。
溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降低10℃，ϕ f增加3％，在−80℃时， ϕ f为1。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于−NH2为提高荧光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收
光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
5.荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
6、散射光
小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。
瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只
是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。
拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长
的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取
措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光
与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发
选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰
a:320nm或350nm为激发
光，荧光峰总是在448nm。
b:将空白溶剂分别在320nm
及350nm激发光照射下测定
荧光，激发光波长为320nm
时，拉曼光波长是360nm，
360nm的拉曼光对荧光无影
响；当激发光波长为350nm
时，拉曼光波长是400nm，
400nm的拉曼光对荧光有干
荧光试剂四、四、荧光荧光试剂
荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围
有机化合物的荧光分析1.1.有机化合物的荧光分析
脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香 脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物
)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。(衍生化衍生化)
能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：
1．荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型反应如下：
荧光胺及其水解产物不显荧光。100mg荧光胺溶于100ml无100mg100ml
mg药物的甲醇或水水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于1010mg
lml，加适宜pH值的磷酸缓冲溶液5ml，加荧光胺试剂0.lml，溶液0.0.lml0.lml混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条件为：λex=275、390nm，λem=480nm。
2．邻苯二甲醛(OPA)
在2−巯基乙醇存在下，pH9～10的缓冲溶液中OPA能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a−
ml乙氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA 500mg溶于1010ml
ml 2−巯基乙醇，将此混合液加至1L 3％的硼醇中，加200200ml 2
酸溶液中，再用KOH调节至pH10，即为常用试剂溶液。荧光条件为：λex=340nm，λem=455nm。
3．1−二甲氨基−5−氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯) 能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。
mg或100mg试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用。取5050mg100mg500ml
与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼(Dansyl－NHNH2)，它能与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：λex=365nm，λem=500nm左右。
丹酰氯试剂不稳定，其水解产物Dansyl−OH呈蓝色荧光，必须暗处保存，每周重新配制。
2.生物与有机化合物的分析
2.无机化合物的分析
无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配 无机离子一般不显荧光，无机离子一般不显荧光，与有机试剂形与有机试剂形成有荧光的成有荧光的配，可测量约60种元素及离子合物后合物后，可测量约6060种元素种元素及离子
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土——采用荧光分析法 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土
氟、硫、铁、银、钴、镍——采用荧光熄灭法测定 氟、硫、铁、银、钴、镍
铜、铁、钴、锇及过氧化氢——采用催化荧光法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢
铬、铌、铀、碲——采用低温荧光法测定 铬、铌、铀、碲
铈、铕、锑、钒、铀——采用固体荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀
二、定量分析方法
1.标准曲线法
配制一系列标准浓度试样，测定荧光强度，绘制F-c的标准校正曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出试样的浓度
空白调0，标品调100%或50%
2. 比较法
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之
x荧光光谱分析仪
x荧光光谱分析仪 X射线荧光分析技术(XRF)作为一种快速分析手段,为我国的相关部门提供了一种可行的、低成本的并且及时的检测、筛选和控制有害元素含量的有效途径。相对于其他分析方法(例如发射光谱、吸收光谱、分光光度计、色谱质谱等),XRF具有无需对样品进行特别的化学处理。x荧光光谱分析仪
仪器简介：
扩展的偏振光学系统使用50W低能量的X射线管作为辐射源，用于Na-U元素的同时分析。从X射线管中发出的原始X射线通过高通量偏振光学系统进行转换，得到的完全偏振且部分单色的X射线可以高灵敏地测定各种元素。
可广泛地应用于石油、化工、冶金、矿业、制药、食品、环保、地质、建材、废物处理以及再加工工业等。
XEPOS型x荧光光谱分析仪可广泛应用于各种电子材料及塑料中铅、镉、（汞）等元素分析，检出下限低，灵敏度高、稳定性好，可应对欧洲WEEE、ROHS指令以及SONY STM-0083标准。
技术参数：
1.功率50W，最大电压50KV，最大电流2mA
2.50W端窗Pd靶X光管
3.硅漂移计数器，分辨率小于170eV
4.3位置次级靶自动转换系统，即3束X激发光源。
5.可选真空、充气、常压系统
主要特点：
1.偏振X光激发样品，具有极低的背景，极佳的灵敏度
2.真正意义的Na-U的全分析，无需滤光片。
3.分析的含量范围ppm级到100%
4.极为丰富的软件系统，提供各种方法及校正模式。
实验六 材料荧光光谱分析
（一）实验目的要求
发光材料的光谱性能与材料的基质组成、掺杂种类及浓度、制备方法、制备工艺等密切相关，通过材料的激发光谱、发射光谱的测试和分析，可以获得有效激发光范围、发射光能量分布、发射光颜色等信息，对于改进材料的配方和工艺具有重要的作用。
本实验的目的要求：
1. 了解紫外-可见荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。
2. 掌握紫外-可见荧光分光光度计的测试原理及特点。
3. 学会紫外-可见荧光分光光度计样品的制备方法。
4. 掌握激发光谱、发射光谱的测试过程和结果分析。
（二）实验设备
本实验使用的仪器是WGY-10型荧光分光光度计。由光源、风扇、机箱和信号接收处理系统四大部分组成。其中光源部分内有氙灯和钨灯两种激发源，外有切换杆；风扇部分是高速旋转的扇页；机箱内有反射镜、光栅、滤波片、样品室等；信号的接收处理由程序控制完成。
（三）实验原理
激发光谱是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）的变化。因此，激发光谱反映不同波长的光激发材料的效果。激发光谱的横轴代表所用的激发光波长，纵轴代表发光的强弱，可以用能量或发光强度表示。
发射光谱是指发光的能量按波长或频率的分布，许多发光材料的发射光谱是连续的谱带，分布在很广的范围。
一般地，光谱的形状可以用高斯函数来表示，即
EV = EV0 exp[-a(υ-υ0)2]
其中υ是频率，EV是在频率υ附近的发光能量密度相对值，EV0是在峰值频率υ0时的相对能量，а是正的常数。一般的发光谱带，至少近似地都可以用如上公式表示。
（四）样品制备
1. 块状试样
块状试样可以直接用双面胶粘结在样品台上，注意保证激发光能够照射到待测样品的表面。
2. 粉末试样
粉末试样可适当添加不影响光谱特性的调节剂（也可以不加任何试剂），置于样品台凹槽中，用玻璃片碾平，固定到样品座中即可。
3. 液体试样
液体试样置入专用的液体样品槽中，置入样品室中即可。
（五）实验步骤
1. 通电，先开氙灯，接着开风扇；
2. 待氙灯启动高压稳定之后，开启电脑，进入程序控制软件，初始化；
3. 选择扫描工作方式，测发射光谱时选择发射扫描，测激发光谱选择激发扫描；
4. 选择扫描波长范围，默认为220~760nm；
5. 选择激发狭缝、发射狭缝、负高压；
6. 测试并记录数据。
（六）测试内容
1. 激发光谱
5000
4000
Intensity/a.u.30002000
1000
200250****00650
wavelength/nm
激发光谱样例（λem= xx nm）
2. 发射光谱
5000
4000
Intensity/a.u.3000200****0
550600****00750
wavelength/nm
发射光谱样例（λex= xx nm）
（七）实验报告要求
1. 应包括实验目的、实验原理，样品制备方法及测试步骤。
2. 要求附上测试结果，并对测试内容进行结果分析。
1
分子荧光光谱
Molecular Fluorescence Spectroscopy
原文地址荧光光谱分析.htm
一．概述二．荧光光谱的基本原理
三．分子结构与测试条件对荧光光谱的影响 四．荧光光谱的分析技术及应用
原文地址荧光光谱分析.htm
一．概述荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后进 入激发态，并且立即退激发并发出比入 射光的的波长长的出射光（通常波长在
可见光波段）；而且一旦停止入射光，
发光现象也随之立即消失。具有这种性 质的出射光就被称之为荧光。
原文地址荧光光谱分析.htm
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶。用荧光抗体染色之 原生动物
原文地址荧光光谱分析.htm
光致发光 物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产 生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传 递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。
原文地址荧光光谱分析.htm
分子荧光光谱法的特点灵敏度高
检测限可达ppb量级（10-9）；
荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光 成直角的方向上检测； 荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高
于紫外-可见吸收光谱，适合于痕量物质的检测。
原文地址荧光光谱分析.htm
信息量较大 荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、 峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光
产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个 过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大 约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8 秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决 于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命， 因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。
原文地址荧光光谱分析.htm
二．荧光光谱基本原理1.光谱类型
荧光光谱是物质分子吸收紫外 光后产生的分子发射光谱。
2.跃迁类型
分子中原子的电子能级跃迁 ，伴随振动能级的跃迁。
原文地址荧光光谱分析.htm
3.分子的激发与失活 （1）分子的激发 • 基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 • 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。原文地址荧光光谱分析.htm
•单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。 •三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。
原文地址荧光光谱分析.htm
① 大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋 方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子 在基态时处于单重态。 ② 分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发 态中的某个振动能级，分子仍处于单重态。持续一段时间后 ，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态. ③ 单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子 通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率 很小。
原文地址荧光光谱分析.htm
（3）跃迁的方式与激发态分子失活：原文地址荧光光谱分析.htm
① 无辐射跃迁• 振动弛豫： 由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较 高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 激发态分子常常首先发生振动驰豫。 • 内转换： 相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能 级的分子内过程。
原文地址荧光光谱分析.htm
• 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生 变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间 窜跃最常见。 • 外转换： 激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧 光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。
原文地址荧光光谱分析.htm
② 辐射跃迁• 磷光： • 若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三 重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然 后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。 • 由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长 比荧光的波长稍长。 • 磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷 光很少应用于分析。
原文地址荧光光谱分析.htm
• 荧光：• 受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到 达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的 形式失活回到基态，发出荧光。
• 由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧
光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发 光波长长。
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荧光产生的过程：原文地址荧光光谱分析.htm
4.激发谱与发射谱任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光 或磷光光谱)两种特征光谱.
原文地址荧光光谱分析.htm
激发谱： 荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的 荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对 效率。 发射谱： 某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分 布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。原文地址荧光光谱分析.htm
激发光谱和发射光谱具 有三个特点： ⑴ 斯托克斯位移，波长： 荧光＞激发光； ⑵ 荧光光谱和激发光谱 大致成镜像对称； ⑶ 荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。
蒽的激发光谱和荧光光谱
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/nm 蒽(乙醇)的激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱原文地址荧光光谱分析.htm
5.荧光寿命(τf)荧光寿命(τf)： • 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大 荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s) 。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光
激发后，荧光 强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：
Ft=F0e-Kt。
• F0、Ft ：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。
原文地址荧光光谱分析.htm
5.荧光强度荧光产率()：又称为荧光量子产率、荧光效率。
发射荧光的光子数 荧光产率 吸收激发光的光子数
椐据Beer-Lambert定律可以推得荧光强度F： Fλ=2.3I0 (A)C·· l· Z 式中 (A)为激发波长A处的消光系数，Ｃ为样品分子的 浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程 （样品池光径）
原文地址荧光光谱分析.htm
三．分子结构与测试条件对荧光光谱 的影响（1）荧光与结构的关系
• 电子跃迁类型 *→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小， 有利于荧光的产生。 • 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。 具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产 生荧光。
原文地址荧光光谱分析.htm
• 平面刚性结构效应可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧 光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚
酞却没有。
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取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度， 使 荧 光 效 率 提 高 ， 荧 光 波 长 长 移 。 如 ： － NH2 、 － OH、 －
OCH3 、－NHR、－CN等。
第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使 荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2 、－CO、－NO、 －SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。 第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明 显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。
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• 取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。
化合物 C6H6（苯） C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN C6H5Cl C6H5Br C6H5I 相对荧光强度 10 3 0 17 18 20 20 20 7 5 0 荧光波长/nm 270~310 310~390 270~320 285~365 285~345 310~405 280~360 275~345 290~380
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（2）影响应该强度的因素① 内部因素 • 自猝灭— 发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝
灭随溶液浓度的增加而增加。
• 自吸收— 荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，
从而使荧光被减弱。 • 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高 荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来 提高灵敏度。
溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，
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② 环境因素温度:
温度对荧光的影响很大，温度降低会减少碰撞和非辐射 失活的概率，因此会增加荧光强度。 例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产 率增加3%，
当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。
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pH值:含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。 pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发 生变化。 化合物 C6H5OH C6H5O— C6H5NH2 C6H5NH3
+
相对荧光强度 18 0 20 0
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溶剂• 溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。 • 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变， 会使荧光强度、荧光波长改变。 • 含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷 光增强。
溶解氧
• 往往使荧光强度降低。
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四．荧光光谱技术分析与应用1. 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：
激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
I0 F I
原文地址荧光光谱分析.htm
• 光源： 最常用的是高压汞蒸气灯。发出的是较强的线状谱，其中 365，398，436，546，579，690，734nm谱线较强。大多数 荧光化合物都可以在一定波长范围内用不同波长的光诱发荧 光，因此通常至少有一条汞线是适用的。 高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，克服了汞蒸 气灯射线数目少、强度差别大的缺点。但氙弧灯热效应大， 稳定性较差。 高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的 单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。 钨灯和氢灯发出的紫外光强度太小，在荧光中应用不多。原文地址荧光光谱分析.htm
• 单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。 • 样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 • 检测器： 光电倍增管。原文地址荧光光谱分析.htm
2. 荧光法的应用： 常规荧光光谱测试：（1）在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意
选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描， 从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2； （2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的
扫描，确定最佳的激发光波长λ1 。
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定量荧光光谱测试：① 标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标 准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度 ，在标准曲线上求出浓度。 ② 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再 进行比较。
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无机物的荧光分析• 无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作
用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非
过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。 • 荧光试剂是具有两个或以上与Mn+形成螯合物的电子给予体官能团的 芳香结构。
OH
N ON 8-羟基喹啉
OH HO
N=N 石榴
茜素R SO3Na
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• 无机化合物的分析： • 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； • 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； • 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； • 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； • 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。原文地址荧光光谱分析.htm
有机物的荧光分析• 荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂 肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。
名
称
结 构 式
CH2N2
应
用
9-蒽基重氮甲 烷
某些羧酸
丹磺酰氯
N(CH3)2
伯胺、仲胺、 酚或氨基酸
SO2Cl
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荧光光谱在生物与医学上的应用核壳荧光纳米颗粒在小白鼠体内的代谢研究，静脉注射RuBPY荧 光纳米颗粒30min，5h，24h 和 96h后肾脏组织的光学和荧光成像
原文地址荧光光谱分析.htm
核壳荧光纳米颗粒与活细胞的生物亲和性研究a
b
HNE1细胞与二氧化硅壳荧光纳米颗粒的生物亲和性，连续培养 10天，细胞传代四次。（a）没有吞噬纳米颗粒的细胞；（b）吞噬 纳米颗粒的细胞。
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A 单个细菌的检测O157:H7大肠杆菌的成像 (A)被识别的O157:H7大肠杆菌的SEM成像。 (B)被识别的O157:H7大肠杆菌的荧光成像。
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B 疾病早期诊断明视场光学图像
荧光图像
通过使用基于Ab-Ag 反应标记的荧光纳米 颗粒进行红斑狼疮(SLE)的诊断
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明视场光学图象荧光图象
吞噬了pH纳米传感器的小鼠巨噬细胞分子荧光光谱
Molecular Fluorescence Spectroscopy
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一．概述二．荧光光谱的基本原理
三．分子结构与测试条件对荧光光谱的影响 四．荧光光谱的分析技术及应用
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一．概述荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后进 入激发态，并且立即退激发并发出比入 射光的的波长长的出射光（通常波长在
可见光波段）；而且一旦停止入射光，
发光现象也随之立即消失。具有这种性 质的出射光就被称之为荧光。
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澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶。用荧光抗体染色之 原生动物
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光致发光 物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产 生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传 递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。
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分子荧光光谱法的特点灵敏度高
检测限可达ppb量级（10-9）；
荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光 成直角的方向上检测； 荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高
于紫外-可见吸收光谱，适合于痕量物质的检测。
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信息量较大 荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、 峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光
产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个 过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大 约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8 秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决 于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命， 因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。
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二．荧光光谱基本原理1.光谱类型
荧光光谱是物质分子吸收紫外 光后产生的分子发射光谱。
2.跃迁类型
分子中原子的电子能级跃迁 ，伴随振动能级的跃迁。
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3.分子的激发与失活 （1）分子的激发 • 基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 • 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。阅读详情.html
•单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。 •三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。 激发三重态能量较激发单重态低。
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① 大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋 方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子 在基态时处于单重态。 ② 分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发 态中的某个振动能级，分子仍处于单重态。持续一段时间后 ，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态. ③ 单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子 通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率 很小。
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（3）跃迁的方式与激发态分子失活：阅读详情.html
① 无辐射跃迁
• 振动弛豫： 由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较 高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 激发态分子常常首先发生振动驰豫。 • 内转换： 相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能 级的分子内过程。
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• 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生 变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间 窜跃最常见。 • 外转换： 激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧 光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。
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② 辐射跃迁• 磷光： • 若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三 重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然 后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。 • 由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长 比荧光的波长稍长。 • 磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷 光很少应用于分析。
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• 荧光：• 受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到 达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的 形式失活回到基态，发出荧光。
• 由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧
光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发 光波长长。
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荧光产生的过程：阅读详情.html
4.激发谱与发射谱任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光 或磷光光谱)两种特征光谱.
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激发谱： 荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的 荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对 效率。 发射谱： 某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分 布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。阅读详情.html
激发光谱和发射光谱具 有三个特点： ⑴ 斯托克斯位移，波长： 荧光＞激发光； ⑵ 荧光光谱和激发光谱 大致成镜像对称； ⑶ 荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。
蒽的激发光谱和荧光光谱
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5.荧光寿命(τf)荧光寿命(τf)： • 除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大 荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s) 。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光
激发后，荧光 强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：
Ft=F0e-Kt。
• F0、Ft ：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。
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5.荧光强度荧光产率()：又称为荧光量子产率、荧光效率。
发射荧光的光子数 荧光产率 吸收激发光的光子数
椐据Beer-Lambert定律可以推得荧光强度F： Fλ=2.3I0 (A)C·· l· Z 式中 (A)为激发波长A处的消光系数，Ｃ为样品分子的 浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程 （样品池光径）
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三．分子结构与测试条件对荧光光谱 的影响（1）荧光与结构的关系
• 电子跃迁类型 *→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小， 有利于荧光的产生。 • 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。 具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产 生荧光。
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• 平面刚性结构效应可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧 光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚
酞却没有。
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取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度， 使 荧 光 效 率 提 高 ， 荧 光 波 长 长 移 。 如 ： － NH2 、 － OH、 －
OCH3 、－NHR、－CN等。
第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使 荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2 、－CO、－NO、 －SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。 第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明 显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。
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• 取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。
化合物 C6H6（苯） C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN C6H5Cl C6H5Br C6H5I 相对荧光强度 10 3 0 17 18 20 20 20 7 5 0 荧光波长/nm 270~310 310~390 270~320 285~365 285~345 310~405 280~360 275~345 290~380
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（2）影响应该强度的因素① 内部因素 • 自猝灭— 发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝
灭随溶液浓度的增加而增加。
• 自吸收— 荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，
从而使荧光被减弱。 • 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高 荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来 提高灵敏度。
溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，
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② 环境因素温度:
温度对荧光的影响很大，温度降低会减少碰撞和非辐射 失活的概率，因此会增加荧光强度。 例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产 率增加3%，
当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。
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pH值:含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。 pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发 生变化。 化合物 C6H5OH C6H5O— C6H5NH2 C6H5NH3
+
相对荧光强度 18 0 20 0
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溶剂• 溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。 • 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变， 会使荧光强度、荧光波长改变。 • 含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷 光增强。
溶解氧
• 往往使荧光强度降低。
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四．荧光光谱技术分析与应用1. 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：
激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
I0 F I
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• 光源： 最常用的是高压汞蒸气灯。发出的是较强的线状谱，其中 365，398，436，546，579，690，734nm谱线较强。大多数 荧光化合物都可以在一定波长范围内用不同波长的光诱发荧 光，因此通常至少有一条汞线是适用的。 高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，克服了汞蒸 气灯射线数目少、强度差别大的缺点。但氙弧灯热效应大， 稳定性较差。 高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的 单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。 钨灯和氢灯发出的紫外光强度太小，在荧光中应用不多。阅读详情.html
• 单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。 • 样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 • 检测器： 光电倍增管。阅读详情.html
2. 荧光法的应用： 常规荧光光谱测试：（1）在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意
选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描， 从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2； （2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的
扫描，确定最佳的激发光波长λ1 。
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定量荧光光谱测试：① 标准曲线法：
配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标 准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度 ，在标准曲线上求出浓度。 ② 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再 进行比较。
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无机物的荧光分析• 无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作
用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非
过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。 • 荧光试剂是具有两个或以上与Mn+形成螯合物的电子给予体官能团的 芳香结构。
OH
N ON 8-羟基喹啉
OH HO
N=N 石榴
茜素R SO3Na
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• 无机化合物的分析： • 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； • 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； • 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； • 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； • 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。阅读详情.html
有机物的荧光分析• 荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂 肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。
名
称
结 构 式
CH2N2
应
用
9-蒽基重氮甲 烷
某些羧酸
丹磺酰氯
N(CH3)2
伯胺、仲胺、 酚或氨基酸
SO2Cl
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荧光光谱在生物与医学上的应用核壳荧光纳米颗粒在小白鼠体内的代谢研究，静脉注射RuBPY荧 光纳米颗粒30min，5h，24h 和 96h后肾脏组织的光学和荧光成像
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核壳荧光纳米颗粒与活细胞的生物亲和性研究a
b
HNE1细胞与二氧化硅壳荧光纳米颗粒的生物亲和性，连续培养 10天，细胞传代四次。（a）没有吞噬纳米颗粒的细胞；（b）吞噬 纳米颗粒的细胞。
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A 单个细菌的检测O157:H7大肠杆菌的成像 (A)被识别的O157:H7大肠杆菌的SEM成像。 (B)被识别的O157:H7大肠杆菌的荧光成像。
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B 疾病早期诊断明视场光学图像
荧光图像
通过使用基于Ab-Ag 反应标记的荧光纳米 颗粒进行红斑狼疮(SLE)的诊断
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明视场光学图象荧光图象
吞噬了pH纳米传感器的小鼠巨噬细胞
第5章荧光光谱
5.1 基本原理
5.2 荧光探测
5.3 荧光光谱的应用
1/45
51基本原理5.1
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光致发光，发射光谱，吸收+发射光致发光可以在紫外-可见光区、X射线区等2/45
55.1.1 11荧光发光原理
3/45
光致发光的能级向下跃迁过程①无辐射跃迁：激发态→第一电子激发态的最低能级在激发态因碰撞以热的形式损失能量跃迁到第电子在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子激发态的最低能级
②荧光发射：第一电子激发态的最低能级→基态能级由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释放能量，即荧光
③磷光发射：三重态→基态能级
先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级发射磷光能级，发射磷光
4/45
荧光与磷光的区别
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从激发态跃迁到基态的路径不同9~107s
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从激发到发光的时间不同，荧光从激发到发光的时间不同荧光10-910-7磷光10-3~10s ((三重态是亚稳态重态是稳态)
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发光波长不同，荧光波长比磷光波长短5/45
51
2荧光光谱与吸收光谱5.1.2
6/45
紫外-可见吸收光谱
光谱类型
波长范围吸收光谱荧光光谱发射光谱紫外200-380 nm，可见380-760 nm
ppb量级，10-9探测灵敏度不如荧光光谱高
产生机理
光谱形状电子能级跃迁，一次跃电子能级跃迁，两次跃迁吸收迁，吸收迁吸收+激发迁，吸收带状、连续
呈镜像关系荧光谱带波长比吸收谱带波长长呈镜像关系，荧光谱带波长比吸收谱带波长长吸收光谱可能存在多套光谱
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分子结构与荧光效率
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具有大共轭双键的分子容易发射荧光，π→π*跃迁的量子效率高，寿命短（10-9~10-7s）阅读详情.html
共轭效应越大，荧光效率越高，苯苯
萘
蒽
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刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而减小与其它分子碰撞的可能芴≈1.0>联苯0.18减小与其它分子碰撞的可能，芴
芴联苯
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COOH水杨酸
OH无荧光有荧光
氢键形成平面刚性结构！
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取代基也会影响荧光效率给电子基(-NH2, OH)会增强荧光效率（共轭作用）
吸电子基(-NO2, -C=O, -C=NH)会减弱甚至猝灭荧光
取代基的空间阻碍作用会减弱荧光
NH2OH50倍荧光强度
COOHNO2I无荧光
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514影响荧光光谱的外部因素5.1.4
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入射光强，荧光强度与入射光强成正比阅读详情.html
溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用
增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加
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温度，升高温度→ 物质粒子碰撞增多→ 减弱荧光阅读详情.html
ppH值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大阅读详情.html
内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光阅读详情.html
自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收溶液浓度较大时部分荧光会被物质本身吸收13/4513/45
吸收光谱与荧光强度（激发的选择？）
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吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃迁产生的荧光越强吸收光谱
吸光度荧光光谱
波长波长
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550nm
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荧光光谱的定量分析：荧光与吸收光强：IF=φIA
朗伯-比尔定律：(I−εbc
0−IA)=I0⋅10}
Ibc
F=φI0(1−10−ε)
稀溶液近似
IF=2.303φI0εbcb
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例题假设某物质的吸收截面为σ=10-15cm2，用功率为用功率为10mW、波长为波长为λ=500nm的激光激发荧光。如果聚焦体积为5mm×1mm2，荧光量子效率为0.5，荧光收集效率为10%，用量子效率为η=25%的光电倍增管探测，那么可以探测到的最小分子浓度Ni是多少？假设光电倍增管的暗电流为每秒10个光生电子，信噪比大于3:1。
解：要求最小的单位时间内的吸收光强为：
I=10*3/0.25/0.1/0.5=2400 (个光子)
单位时间内激光发射的光强为：
I0=10/hv=2.5*1016(个光子)
由吸收定律得到：
Ni=lg[I0/(I0-I)]/ (σ*b)=83 (个/cm3)
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55.2 2荧光探测
吸收光谱
两点区别：
11.在入射光的垂直方向探测
2.探测器前还有一个单色器荧光光谱
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荧光光谱直接测量有两种形式：荧光光谱直接测量有种式
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激发光谱：固定荧光发射波长，扫描激发波长，与吸收光谱类似阅读详情.html
发射光谱：固定荧光激发波长，扫描发射波长，这才是真正固定荧光激发波长扫描发射波长这才是真正意义上的荧光光谱阅读详情.html
往往有些物质的激发光谱相似，但是发射光谱不同，所以荧光测量具有更好的特异性21/4521/45
F4500
荧光光度计光路图（日立）F-4500
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更多的荧光探测技术
(1) 三维荧光光谱
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激发波长+发射波长+荧光强度，完整地描述了物质的荧光强度完整地描述了物质的荧光特征阅读详情.html
总发光光谱、等高线谱、激发-发射矩阵、全扫描荧光光谱阅读详情.html
在每个激发波长下测量荧光光谱23/4523/45
（2）同步荧光光谱技术
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在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光强，由测得的荧光强度对发射或激发波长作图阅读详情.html
两种同步扫描形式——固定波长和固定能量（波长或能量间隔的选择很重要，选择恰好等于某吸收带和发射带波长间距）阅读详情.html
固定波长：激发波长与发射波长间隔固定（沿三维谱的45度方向就可得到固定波长的同步荧光光谱）阅读详情.html
固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定阅读详情.html
特点：①与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善②能够增强强带而减小弱带的干扰
③它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低，但同时会把
拉曼吸收峰拉宽
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(4
个苯环)的同步荧光光谱
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丁省
（3
）激光诱导荧光光谱技术
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使用激光代替普通光源激发荧光阅读详情.html
具有如下特点：阅读详情.html
信噪比更好，灵敏度更高：激光强度大，方向性好（对荧光干扰小），谱线窄（容易用滤波器滤除）阅读详情.html
选择性高：只有与分子能级间隔相匹配的激光才能被吸收而激发出荧光阅读详情.html
适合于微区分析：激光光束可以聚焦成很小的光斑阅读详情.html
其它：可调谐激光器可省去激发单色仪27/4527/45
脉冲取样积分技术
聚光镜
分光镜
脉冲激光器
样品池
高速光敏二极管
单色器电源
光电取样触发信号
倍增管
记录器
取样积分器
电源
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时间相关单光子计数关单光子计数
分光镜
脉冲激光器
聚光镜
样品池
电源
光电
倍增管A电压甄别器A
启启动
单色器光电
倍增管B
停止
电源
记录仪
多道分析仪时幅转换器可调延迟装置电压甄别器B
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光电倍增管A产生的信号通过电压甄别器A产生产生一系列脉冲信号，脉冲信号将系列脉冲信号，脉冲信号将启动时幅转换器工作，使其产生一个随时间线性增长的电压信号阅读详情.html
光电倍增管B探测荧光信号，通过电压甄别器B产生脉冲信号，脉冲信号将在时间t终止时幅转换器工作，并将脉冲存入多通道分析仪中与时间对应的相应通道阅读详情.html
要求光电倍增管B产生的荧光脉冲只有1个U
U=U0（t-t0）
脉冲计数
激光脉冲
t
通道序数
荧光光子t
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相移法移
聚光镜
激光器
泡克尔斯盒
电源
光电
倍增管A
单色器光电倍增管B
相位比较器
电源
分光镜
样品池
记录仪
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以频率Ω正弦调制激发光振幅，荧光振幅也将以频率Ω变化，但是由于荧光发射需要时间，它与激发光之间存在相位延迟，该相位延迟与荧光寿命成正比
tan(φ)=Ωτeff
强度
激发光
荧光
时间
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53荧光光谱的5.3 荧光光谱的应用应用
如何利用荧光进行物质分析？
(1) 物质本身具有荧光特性，芳香族化合物，色氨酸
（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）
(2) 待测物质与荧光试剂结合后形成能发射荧光的物质无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物物质，
(3) 将待测物质用荧光团（荧光探针）进行标记，
专一而牢固的结合，结合不会破坏物质分子的结构和空间构象
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常用有机荧光试剂
待测离子Al3+，Fe-B4O22-Sn4+Li+
荧光试剂茜素紫酱R苯偶姻黄烷醇8-羟基喹啉
吸收波长470 nm370 nm400 nm370 nm
荧光发射波长
500 nm450 nm470 nm580 nm
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一些典型的荧光团些典型的荧光团
色氨酸348 nm
4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚
增强型绿色荧光蛋白
461461 nm
nm509509 nm
nm四甲基罗丹明576 nm染料667 nm
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绿色荧光蛋白（GFP
）——一种广泛应用的活体蛋白
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激光诱导荧光光谱检测大气中的SO
2
MMatrumi YtiY, et al. Atmospheric Enviroment, 2005,39: 3177-3185tlAthiEit200539****3185
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荧光法在线检测纸中的木质素含量激发波长
532nm
Ramasubramanian M K, et al. IEEE Sensor
Journal, 2005, 5(5): 1132-113941/4541/45
荧光光谱研究异黄酮与BSA
的相互作用
没有异黄酮
存在异黄酮
Roy A S, et al. Spectrochimica Acta Part A, 2013,102: 393-40242/4542/45
利用同步荧光光谱分离色氨酸1、酪氨酸酪氨酸
2和苯丙氨酸3的重叠荧光峰
一般荧光光谱
张悦等. 食品科学,, 2010,31(16): 204-207,()同步荧光光谱(波长差70nm)
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纳米线荧光的测量
Xiao Y, et al. Nano Letter, 2011,11: 1122-112644/4544/45
课堂练习1．氧气在氧气在760 nm附近的吸收截面约为10-27cm2，假设在，假设在一个光程为个光程为1 m的气体容器中充入氧气，测得吸光度为0.1，试问容器中单位体积内有多少个氧气分子？
2. 化合物C2H4与CH2=CH-CH=CH2在紫外光谱上有什么差别？为什么？
3．下列化合物中，荧光信号显著的化合物是( )
4．荧光分光光度计中光源与检测器呈5．荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光信号。（）
6．发荧光时，电子能量的转移没有电子自旋的改变；发磷光时，电子能量的转移伴随电子自旋的改变。（）
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X荧光光谱仪
1 X 荧光光谱仪技术原理
X荧光光谱仪（XRF）由激发源（X射线管）和探测系统构成。X射线管产生入射X射线（一次X射线），激发被测样品。受激发的样品中的每一种元素会放射出二次X射线，并且不同的元素所放射出的二次X射线具有特定的能量特性或波长特性。探测系统测量这些放射出来的二次X射线的能量及数量。然后，仪器软件将探测系统所收集到的信息转换成样品中各种元素的种类及含量。
元素的原子受到高能辐射激发而引起内层电子的跃迁，同时发射出具有一定特殊性波长的X射线，根据莫斯莱定律，荧光X射线的波长λ与元素的原子序数Z有关，其数学关系如下： λ=K(Z− s) −2
式中K和S是常数。
而根据量子理论，X射线可以看成由一种量子或光子组成的粒子流，每个光具有的能量为： E=hν=h C/λ
式中，E为X射线光子的能量，单位为keV；h为普朗克常数；ν为光波的频率；C为光速。 因此,只要测出荧光X射线的波长或者能量,就可以知道元素的种类，这就是荧光X射线定性分析的基础。此外,荧光X射线的强度与相应元素的含量有一定的关系，据此，可以进行元素定量分析。
2 X荧光光谱仪主要用途
X荧光光谱仪根据各元素的特征X射线的强度，也可以获得各元素的含量信息。 近年来，X荧光光谱分析在各行业应用范围不断拓展，已成为一种广泛应用于冶金、地质、有色、建材、商检、环保、卫生等各个领域，特别是在RoHS检测领域应用得最多也最广泛。 大多数分析元素均可用其进行分析，可分析固体、粉末、熔珠、液体等样品，分析范围为Be到U。并且具有分析速度快、测量范围宽、干扰小的特点。
3 X荧光光谱仪的优缺点
3.1 优点
a) 分析速度高。测定用时与测定精密度有关，但一般都很短，2～5分钟就可以测完样品中的全部待测元素。
b) X射线荧光光谱跟样品的化学结合状态无关，而且跟固体、粉末、液体及晶质、非晶质等物质的状态也基本上没有关系。（气体密封在容器内也可分析）但是在高分辨率的精密测定中却可看到有波长变化等现象。特别是在超软X射线范围内，这种效应更为显著。波长变化用于化学位的测定 。
c) 非破坏分析。在测定中不会引起化学状态的改变，也不会出现试样飞散现象。同一试样
可反复多次测量，结果重现性好。
d) X射线荧光分析是一种物理分析方法，所以对在化学性质上属同一族的元素也能进行分析。
e) 分析精密度高。
f) 制样简单，固体、粉末、液体样品等都可以进行分析。
3.2 缺点
a）难于作绝对分析，故定量分析需要标样。
b）对轻元素的灵敏度要低一些。
c）容易受相互元素干扰和叠加峰影响。
4X荧光光谱仪的分类
X荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型（WD-XRF）和能量色散型（ED-XRF）。 以X荧光的波粒二象性中波长特征为原理的称为波长色散型，以能量特征为原理的称为能量色散型。
X射线
X射线的特征是波长非常短，频率很高。因此X射线必定是由于原子在能量相差悬殊的两个能级之间的跃迁而产生的。所以X射线光谱是原子中最靠内层的电子跃迁时发出来的，而光学光谱则是外层的电子跃迁时发射出来的。X射线在电场磁场中不偏转。这说明X射线是不带电的粒子流。
X射线（英语：X-ray），又被称为艾克斯射线、伦琴射线或X光，是一种波长范围在0.01纳米到10纳米之间（对应频率范围30 PHz到30EHz）的电磁辐射形式。X射线最初用于医学成像诊断和 X射线结晶学。X射线也是游离辐射等这一类对人体有危害的射线。
1906年，实验证明X射线是波长很短的一种电磁波，因此能产生干涉、衍射现象。X射线用来帮助人们进行医学诊断和治疗；用于工业上的非破坏性材料的检查。
X射线是波长范围在0.01纳米到10纳米之间（对应频率范围30PHz到30EHz））的电磁波，具波粒二象性。电磁波的能量以光子(波包)的形式传递。当X射线光子与原子撞击，原子可以吸收其能量，原子中电子可跃迁至较高电子轨态，单一光子能量足够高(大于其电子之电离能)时可以电离此原子。一般来说，较大之原子有较大机会吸收X射线光子。人体软组织由较细之原子组成而骨头含较多钙离子，所以骨头较软组织吸引较多X射线。故此，X射线可以用作检查人体结构。
光的偏振
光的偏振（polarization of light）振动方向对于传播方向的不对称性叫做偏振，它是横波区别于其他纵波的一个最明显的标志。光波电矢量振动的空间分布对于光的传播方向失去
对称性的现象叫做光的偏振。只有横波才能产生偏振现象，故光的偏振是光的波动性的又一例证。在垂直于传播方向的平面内，包含一切可能方向的横振动，且平均说来任一方向上具有相同的振幅，这种横振动对称于传播方向的光称为自然光（非偏振光）。凡其振动失去这种对称性的光统称偏振光。
1.电子表的液晶显示用到了偏振光。两块透振方向相互垂直的偏振片当中插进一个液晶盒，盒内液晶层的上下是透明的电极板，它们刻成了数字笔画的形状。外界的自然光通过第一块偏振片后，成了偏振光。这束光在通过液晶时，如果上下两极板间没有电压，光的偏振方向会被液晶旋转90度（这种性质叫做液晶的旋光性），于是它能通过第二块偏振片。第二块偏振片的下面是反射镜，光线被反射回来，这时液晶盒看起来是透明的。但在上下两个电极间有一定大小的电压时，液晶的性质改变了，旋光性消失，于是光线通不过第二块偏振片，这个电极下的区域变暗，如果电极刻成了数字的笔画的形状，用这种方法就可以显示数字。
2. 在摄影镜头前加上偏振镜消除反光。在拍摄表面光滑的物体，如玻璃器皿、水面、陈列橱柜、油漆表面、塑料表面等，常常会出现耀斑或反光，这是由于光线的偏振而引起的。在拍摄时加用偏振镜，并适当地旋转偏振镜面，能够阻挡这些偏振光，借以消除或减弱这些光滑物体表面的反光或亮斑。要通过取景器一边观察一边转动镜面，以便观察消除偏振光的效果。当观察到被摄物体的反光消失时，既可以停止转动镜面。
3. 摄影时控制天空亮度，使蓝天变暗。由于蓝天中存在大量的偏振光，所以用偏振镜能够调节天空的亮度，加用偏振镜以后，蓝天变的很暗，突出了蓝天中的白云。偏振镜是灰色的，所以在黑白和彩色摄影中均可以使用。
4. 使用偏振镜看立体电影在观看立体电影时，观众要戴上一副特制的眼镜，这副眼镜就是一对透振方向互相垂直的偏振片。立体电影是用两个镜头如人眼那样从两个不同方向同时拍摄下景物的像,制成电影胶片。在放映时，通过两个放映机，把用两个摄影机拍下的两组胶片同步放映，使这略有差别的两幅图像重叠在银幕上。这时如果用眼睛直接观看，看到的画面是模糊不清的，要看到立体电影，就要在每架电影机前装一块偏振片，它的作用相当于起偏器。从两架放映机射出的光，通过偏振片后，就成了偏振光.左右两架放映机前的偏振片的偏振化方向互相垂直，因而产生的两束偏振光的偏振方向也互相垂直。这两束偏振光投射到银幕上再反射到观众处，偏振光方向不改变.观众用上述的偏振眼镜观看，每只眼睛只看到相应的偏振光图象，即左眼只能看到左机映出的画面，右眼只能看到右机映出的画面，这样就会像直接观看那样产生立体感觉。这就是立体电影的原理。当然,实际放映立体电影是用一个镜头，两套图象交替地印在同一电影胶片上，还需要一套复杂的装置。光在晶体中的传播与偏振现象密切相关，利用偏振现象可了解晶体的光学特性，制造用于测量的光学器件，以及提供诸如岩矿鉴定、光测弹性及激光调制等技术手段。
5、生物的生理机能与偏振光人的眼睛对光的偏振状态是不能分辨的，但某些昆虫的眼睛对偏振却很敏感。比如蜜蜂有五支眼、三支单眼、两支复眼，每个复眼包含有6300个小眼，这些小眼能根据太阳的偏光确定太阳的方位，然后以太阳为定向标来判断方向，所以蜜蜂可以准确无误地把它的同类引到它所找到的花丛。再如在沙漠中，如果不带罗盘，人是会迷路的，但是沙漠中有一种蚂蚁，它能利用天空中的紫外偏光导航，因而不会迷路。
6、汽车使用偏振片防止夜晚对面车灯晃眼远光灯是非常讨厌的，但是利用光的偏振可以解决这个问题。我们可以将汽车灯罩设计成斜方向45°的偏振镜片，这样射出去的光都是有规律的斜向光。汽车驾驶员戴一副夜间眼镜，偏振方向与灯罩偏振方向相同。如此一来，驾驶员只能看到自己汽车射出去的光，而对面汽车射来光的震动方向，正好是与本方向汽车程90°角，那样对面的车灯光线就不会再晃到驾驶员的眼睛。当然这个设想要实现还是需要很
漫长的道路的，首先世界必须制定一个统一的标准，来规定灯罩与眼镜的偏振方向；其次偏振眼镜必然会损失一部分光线，那么驾驶员的视野会受到影响；而且汽车大灯的功率都很大，其一半的能量都被偏振镜片吸收，一定会产生大量的热，对于汽车灯罩的做工，也是一个非常大的考验。
摘要：选择基本参数法和粉末直接压片改正基体效应的手段，采用APL ADVANT XP型X射线荧光光谱仪（Thermos Fisher公司）实现了浮选磷矿中制样主要指标P2O5、F、SiO2、Al2O3、Fe2O3、MgO、CaO的快速分析，各组分的精密度（N=7）RSD
关键词：磷矿石；Ⅹ射线；荧光光谱分析
1、绪论
定量和定性分析元素的仪器为X射线荧光光谱（XRF），样品的照射是由X射线管进行，从而出现拥有所含有元素各自固有的荧光X射线波长。样品中不同的元素有不同的特定荧光X射线波长，依据特定波长（或测角仪分光晶体的角度）的不同即可定性分析是什么元素。对选定的波长（或测角仪分光晶体的角度）记录其荧光X射线的强度，通过校准曲线换算，即可得到该种元素的定量分析结果。
这个方法是根据含量范围分布、矿物组成、磷矿矿石类型等特点，改正基体效应的手段选择基本参数法和粉末直接压片的方法，拟定了P2O5、F、SiO2、Al2O3、Fe2O3、MgO、CaO主要指标的现场快速分析方法。用XRF光谱法测定选厂的原矿及正浮选尾、精矿中的上述多种组分，制样时间只需2min测量时间为1min，达到了快速分析的要求，数据准确、重复性好，能满足生产要求。
2、实验
2.1标准样品的选择
校准样品采用磷矿石国家一级标准物质，因为校准样品只有3个，数量太少了，存在组分含量范围较窄和含量梯度变化较大的缺点，因此用这些校准样品和岩石标准物质GBW 07101.GBW 07102和土壤标准物质G BW 07401按不同比例混合，研磨，制备人工合成标准物质作为补充。校准样品中各组分的含量范围见表1。
表1校准样品中组分的含量范围
2.2试样制备
在105℃的烘箱内，将磷矿石样品烘2个小时，将吸附水去掉。将烘过的样品6.000g和0.4000gLi2bB4O7-LiBO2混合熔剂放于黄铂金合金坩锅中，搅拌均匀，加入1mL NH，N03饱和溶液和5滴200g/L LiBr溶液，置于熔样机上，在700℃预氧化3min使还原物充分氧化，保护坩锅免受腐蚀，然后升温至1050℃，熔融4min摇动4min，在摇动2min后摇动停止，加入30mgNH4I熔融物立刻变稀，便于赶尽气泡，再摇动最后2min加热铸模的高频线圈升温至850℃，摇动停止后，用坩锅钳夹住坩锅将熔融物倒入铸模内，冷却后自动剥离，把制备好的熔融片贴上标签，待测。
2.3基体效应的校正
经过调研与理论分析，本文使用自动X射线荧光光谱仪分析样品，该仪器含有应用De Jongh公式自动处理数据的软件。应用De Jongh公式分析样品，需要一套相应于分析样品的组成、制样条件以及仪器几何条件的理论Alpha系数。由于没有现成的分析磷矿石的^Alpha系数，所以先由NBSGSC基本参数法程序计算出Lachanc。的Cola公式的Alpha系数，然后再变换为De Jongh公式中消去烧失量项的Alpha系数。
De Jongh公式在PW1400的软件中应用如下形式：
Ci=Di+EiRi）1+∑DDnj=1DD）aijCj）
Cola公式的一般表达式为：
Ci=Ri1+∑DDjDD）a′ijCj+∑DDjDD）∑DDkDD）a′ijCjCk）
对于玻璃熔片Cola公式可以简化为一般的Lachance-Traill公式，即Ci=Ri1+∑DDi≠jDD）aijCj）所以，可以将Lachance-Traill公式中的Alpha系数看作是De Jough公式中消去i项的Alpha系数。再利用改变消去项Alpha系数的转换公式αAij=αAij-αAiB）/1+αAiB）将NBSGS程序计算的Alpha系数转化为De Jough公式中消去烧失量项的Alpha系数。
利用消去烧失量项的Alpha系数，可以不用预先测定样品的烧失量即可对分析元素进行基体校正，这样很方便于磷矿石的日常分析。
3、结果与讨论
3.1熔样比例
分别采用Li2B4O7～LiBO2混合熔剂（质量比67：33）与样品质量比为10：1.15：1.20：1的熔样比例，在其他条件完全相同的情况下，熔融制备玻璃样片，结果显示，熔样比例为10：1，熔融物的流动性稍差；熔样比例为15：1和20：1，熔融物的流动性好，熔片脱模容易考虑到轻元素钠和低含量元素测量误差，本实验选择巧：1的熔样比例。
3.2熔样温度
和实验有关系的目标元素都拥有比较好的稳定性在高温下，所以采用熔样温度不需要思考准备测量的元素的挥发损失问题，而仅需考虑样品在该温度下能否完全熔解，故通过观察样品熔融过程中的实验现象即可确定熔样温度。观察了熔样温度分别为850，950，10501 150℃条件下样品熔解情况，结果表明，当熔样温度设定为850，950℃时，在1min熔融时间结束后，部分样品熔解不完全，可能影响摆动混匀效果，当温度设定为1050、1150℃时，样品于熔融阶段内即可完全熔解。因此熔样温度设定为1050℃。
3.3灼烧减量
减少磷矿石的各个选矿流程样品的灼烧量，拥有非常大的差异，分布范围在5%在30%之内，造成在熔融制样建立校准曲线时各样片实际稀释比差异较大，因此在建立校准曲线时需考虑灼烧减量的影响。分别在不计算灼烧减量、软件自动平衡、手动输入三种模式下建立校准曲线，通过测定方法验证样品进行比较，发现手动输入模式下各元素测定值与理论值最为接近，在实际样品测试过程中选择手动输入模式则需额外测定样品的灼烧减量（L.Q.I=SXm1-m2mSX）×100%，式中：L.Q.I为灼烧减量，%；m1为灼烧前试样坩埚合）重，g；为1000℃灼烧后1.5～2h试样坩锅合重，g；m为样重，g。）。该步骤可与熔片操作同步进行，对方法样品通量并无影响。 3.4校准曲线
3.4.1校准样品的选择
由于目前存在的磷矿石国家标准物质拥有比较少的种类，仅仅有GBW07123、GBW07211、GBW07210，而且其中待测元素含量分布较为分散，无法满足建立校准曲线所需的最低样品数要求，再则日常应用中待测样品中元素含量分布亦更为广泛，校准样品的选择应尽可能覆盖方法要求的元素测定范围。为解决这一问题，实验将GBW07210、GBW07211、GBW0712分别与土壤样品GSS-4以不同比例（m，m）混合以配制待测元素含量具有一定梯度的校准样品序列。
3.4.2校准曲线的建立
在实现对进行扫描前，务必确认好并输入各个被测校准样品与灼烧减量，待仪器逐一测定校准样品强度后，对所得数据进行处理，选择基本参数法或理论a系数法校正基体效应后，逐元素进行重叠干扰校正，以获得各待测元素理想的校准曲线（y为目标组分含量，w/%；x为经校正后的计数率，kcps），见表2。
3.5检出限
根据上述中各分析元素的测量时间，检出限（LD）的计算公式为：
JZLD=SX3mSX）KFSXIbtbSX）KF）
式中，m为单位含量的计数率；Ib为背景计数率；tb为背景的训一数时间。
因为检测出来的元素跟磷矿物相关性，因此不同的样品因组分和含量不同，散射的背景强度也不同，因而检出限也不同。因上述因素，计算出的元素检出限与实际能报出的测定下限会有较大差别。为了克服这些缺点，则选用几个含量接近于检出限的同类标准样品，各制备一个样片，按表1的测量条件，重复测定12次，计算出各标准样品中含量最低的元素所对应的标准偏差0，按3倍标准偏差3计算方法检出限。
4.结论
创建了包括磷矿石选矿流程样品，以主要和次要含量元素为主的XRF分析手段，制造备用样品通过选择熔片法，在校准曲线建立过程中，选择手动输入灼烧减量，经实际样品验证方法有效，P、Ca等主含量精密度 参考文献：
[1]张江坤，张华，余慧茹.用X射线荧光光谱仪测定磷矿多元素分析熔片制样条件的选择磷肥与复肥.2013（01）
[2]李红叶，许海娥，李小莉，李国会，安树清，梁祖顺.熔融制片-X射线荧光光谱法测定磷矿石中主次量组分岩矿测试.2013（04）
[3]王宁伟，朱登峻，朱金连，柳天舒，李丙祥，徐亮.X-射线荧光光谱法测定磷矿中五氧化二磷、氧化钙、三氧化二铁、氧化铝、氧化镁和二氧化硅冶金分析.2014（06）
[4]程雪刚，吴扬，何学忠，庄学甫，包敏，许涛.X-荧光光谱法测定磷矿石中化学成分的研究现代商检科技.2014（02）
[5]杨丽萍.X―ray荧光光谱法在磷肥生产原料分析中的应用贵州化工.2013（04）
[6]王毅民，贺中央.磷矿石中主要和次要组分的X射线荧光光谱分析分析化学.2014（01）
[7]茅祖兴.磷矿石的X射线荧光光谱分析分析化学.2013（10）
原子荧光光谱分析进展
原子荧光光谱法是一种新的痕量分析技术，从发光机理来看，属于发射光谱分析法，但与原子吸收分析也有许多相似之处，可以说原子荧光光谱法是原子发射光谱和原子吸收分析的综合发展。
1964 年，威博尼尔首次将原子荧光应用于分析化学，他利用火焰原子荧光光谱法进行了锌镉和汞的原子荧光分析。此后，1974年 Tsujii 和 Kuga把氢化物发生进样技术与无色散原子荧光分析技术相结合,首次实现了氢化物发生-无色散原子光谱分析，并应用于砷的测定。氢化物发生原子光谱法具有灵敏度高，干扰少的优点，适用范围广，成为环保、食品、生物、冶金、地质、化工样品中痕量元素分析的主要方法之一。为了不断提高测定的灵敏度，近年来有很多改进和发展，使得氢化物发生法应用更为广泛。本部分将对氢化物发生的历史和最新进展加以评述，以推动氢化物发生原子荧光光谱法的发展。
一 氢化物发生法
1.1提出
氢化物发生法是测定在一定条件下将待测元素化合物转化成挥发性氢化物并与基体分离，通过测定生成的氢化物来求得试样中待测元素含量的一种方法。早在100多年前，氢化物发生法就被用来鉴定砷，及众所周知的“马氏试砷法”[1],但氢化物的真正发展还是从现代光谱分析开始的。1951年Kingsley 等
[2] 用HCl-KI-SnCl2-Zn 发生砷化氢，并将其导入碘溶液吸收，然后用砷钼兰比色测定砷。1952 年Vasak 等[3]让产生的砷化氢与二乙基二硫代甲酸银的吡啶氯仿液反应，借生成的红色胶态银以分光光度法测定砷含量。1969 年Holak[4] 用液氮冷凝收集产生的砷化氢，在室温下用氮气将收集的砷化氢导入空气-乙炔火焰中首次将氢化物发生法应用于原子吸收光谱测定以来,该技术得到了很大发展。1974年 Tsujii 和 Kuga把氢化物发生进样技术与无色散原子荧光分析技术相结合,首次实现了氢化物发生-无色散原子光谱分析，并应用于砷的测定。
氢化物发生法的主要特点是实现了气体进样,使得进样效率由气动雾化的
而极大地改善了测定的检出限与精密度。并使被测元素生成氢化物与大量基体元素相分离,检测时几乎无基体光谱干扰。随着新的更为有效氢化物发生手段,以及与其它分离富集技术的联用,氢化物发生法已在原子吸收,原子发射及原子荧光等原子光谱分析中得到广泛的应用[5-6]。早期采用碘化钾溶液和氯化亚锡锌或糊状铝还原产生氢化物[7-10]。由于金属- 慢,可发生的氢化物种类少,见报道的只有AsH3, SeH2 和SbH3,且还原反应受基体的干扰非常严重,很难用于实际样品分析。1972 年, Braman 等报道的使用NaBH4 还原体系可以说是氢化物发生技术发展的里程碑[11]。由于硼氢化钠(钾)还原体系还原速度快,可发生氢化物的元素多,易于各种检测方法联用等优点,
1.2 氢化物的生成
十九世纪以来，一致认为是金属或类金属的还原反应，普遍接受的观点是砷、锑、铋、锡、硒、碲、铅、锗等元素，当与合适的还原剂（硼氢化物或锌）发生反应时，可形成气态氢化物：
NaBH4+3H2O+H+=H3BO3+Na++8H*+Em+=EHn+H2（气体）
式中Em+代表待测元素，EHn为气态氢化物（m可以等于或不等于n）。氢化物
发生原子荧光法就是是利用某些能产生初生态的还原剂或者化学反应，将样品溶液中的分析元素还原为挥发性共价氢化物，然后借助载气流将其导入原子光谱分析系统进行测量的方式。
1.3仪器装置与工作原理
如图1所示，仪器的自动进样器采集的样品，经蠕动泵的转动，被载流推入氢化物发生装置，并于还原剂充分混合，生成的气态氢化物或气态组分被载气引入原子化器进行原子化，气态原子被激发光源激发，随后去激发出荧光信号，经光电倍增管放大后，进入数据处理系统。在仪器工作过程中，两个空心阴极灯被分别以短脉冲调制并加以不同大小的工作电流。由于两灯交替点亮，从而交替激发不同的原子荧光信号，达到双道同时测定的目的。本仪器采用断续流动氢化物发生方法，克服了连续流动进样浪费试液，流动注射装置复杂等缺点。
1.4 发生氢化物的方法
传统氢化物发生进样方式采用一次性氢化物发生进样模式和捕集法，随着计算机技术的发展，氢化物发生及进样技术有了较大的发展。目前，连续流动法
[12]、流动注射法[13]、断续流动法[14-15]在氢化物发生原子荧光法分析中得到了广泛应用。
1.5 氢化物的原子化
生成的氢化物必须进行原子化阶段才能产生荧光谱线，进行原子荧光光谱分析。当前原子化手段可分为火焰原子化和无火焰原子化两大类：
(1)火焰原子化 火焰原子化器是原子荧光分析中最早使用的.火焰原子化的主要过程如下：首先将分析液进行雾化，形成潮湿的气溶胶，气溶胶进入火焰之前，要经过脱溶剂而变成干燥的气溶胶。当送入原子化器时它吸收火焰中的热能后，经过熔融或升华成为分子蒸气，然后其中一部分解离为自由原子，再经激发和去激发的过程而发射出原子荧光。氢－氩焰原子化器在目前商品AFS仪器中广泛应用， 它具有较低的火焰发射和火焰闪变噪声，氩的存在也降低了火焰气体的猝灭、改善了荧光产额，但火焰与原子化的缺点是易出淬火现象、对某些元素的原子化效率很低且试样在火焰中被气体成万倍稀释而不宜得到较好的检出限等使分析效果受到一定限制,亦不适合小体样品分析。
（2）近年来发展了各种无火焰技术则在一定程度克服了上述缺点。一般大都在石墨管中进行。原子化过程分为干燥、灰化、原子化、除残等四个阶段。无火焰原子化的原子化器有两类：高温原子化器：碳针、石墨棒、钽舟、石墨管炉等。
低温原子化器有测汞仪、测砷的原子化器和氢化物石英管原子化器等。电热原子化（ETA）、辉光放电（GD）、空心阴极灯（HCL）和电感耦合等离子体（ICP）以及新兴的激光器等。
1.6 氢化物发生原子荧光光谱法的应用
氢化物原子荧光测定法发展迅速，应用范围日益扩大，已广泛应用于环保、以冶金、生物、化工、地质等样品中微量元素的分析，现将部分应用列于表1
表 1 原子荧光法在分析中的应用
元素
As 方法 NaBH4-乙醇 APDC-MIBK体系
间接法HNO3-K2Cr2O7作汞的保
护剂
抗坏血酸-硫脲还原As
5%碘化钾-5%硫脲-5%抗坏血
酸做预还原剂
10%聚乙烯氧化吡啶-10%甘油
滤纸采样, 预还原剂: 5%硫
脲-5%抗坏血酸,并消除干扰.
Sb 抗坏血酸-硫脲还原Sb，浓盐
酸煮沸还原Se6+,Fe3+消除离
子对Se的干扰
5%碘化钾-5%硫脲-5%抗坏血
酸做预还原剂
预还原剂:硫脲-抗坏血酸-碘
化钾
流动注射法
Se 浓盐酸煮沸还原Se6+,Fe3+消
除离子对Se的干扰
连续流动法，高氯酸硝化，氢 0.39g/L 0.2ng/g 2.3 ng/g 0.08g/L 0.24g/L 10ng/g 检出限 2.8 ng 试样 饮用水 文献 41 42 43 44 45 43 44 46 47 43 48 49 1.3g/L 土壤 太湖底泥 1.2 ng 中草药 粮食 空气 中草药 粮食 土壤 地质样品 中草药 煤浸取液 红细胞膜结合氧化镧共沉淀分离，消除干扰 0.7 ng
分子筛琼脂糖凝胶分离制红
细胞
Bi 硫脲-抗坏血酸,Fe3+加速As
Sb还原.
Hg
Cd 抗坏血酸-硫脲还原 0.44g/L 0.05ppm 硒 地质样品 50 中草药 水溶液 43 17 硫脲还原，Co离子做增敏剂 8 pg/ml
二 氢化物发生原子荧光光谱法的新进展
氢化物原子吸收光谱分析自70年代初到现在已有大量的文献报道，成为一种较成熟的方法，为了提高测定灵敏度、拓展氢化物原子荧光法的应用元素形态和种类范围，分析工作者进行了多方面的工作：一、不断地改进传统AFS系统的光源和原子化系统或使用增敏剂进一步提高分析方法的灵敏度。二、扩展氢化物发生法的元素应用范围和扩大元素的形态分析以及AFS的应用领域。现今就氢化物原子荧光法中的增敏效应和元素形态分析做一简单介绍。
2.1增敏效应氢化物原子荧光光谱法分析
砷、锑、 硒、碲、铅、汞、镉等都是环境分析的重要元素，长期以来如何提高这些元素的蒸气发生效率一直是该领域的一个重要研究方向。镉的氢化物原子荧光光谱法分析起步时采用的是DMF-NaBH4体系或四乙基硼化钠体系，条件较
为苛刻。郭小伟[16]对镉的蒸气发生进行了详细的研究，指出一些有机试剂的引入可以提高镉挥发性化合物的发生效率，并在水相中用KBH4还原体系进行了测
定；郭小伟等[17-18]在研究工作中也发现，一些金属离子的存在可以大幅度地提高某些元素氢化物的生成效率。他们利用硫脲和钴离子极大地提高了镉氢化物的生成效率，克服了以前文献[19-22]报道中方法检出限不能满足实际样品中痕量镉测定的不足。喻昕等[23]据试验推断，Co和硫脲对Cd信号增敏作用主要有两方面：一方面，硫脲改善了溶液的物理性质（如粘度、表面张力等）；另一方面与其中的化学反应有关，硫脲与Cd2＋形成π配键配合物，它与NaBH4释放出的带有
一未成对电子的活性氢发生反应形成CdH2，Co的加入催化了络合物分解。此外，
硫脲的存在改善了CdH2的生成速率及传输速率。Aizpún Fernández等[24]以连续
流动和间断HG-AAS法比较了砷在不同表面活性剂（CTAB，DDAB，SDS和TX-100）中的氢化物发生，综合考虑选择了DDAB作为AsH3的发生介质，并应用于
HG-ICP-AES中。相对于水溶液介质， 在DDAB介质中HG-ICP-AES法测定砷的灵敏度提高了1倍、检出限降低了1.2倍，精密度和抗干扰能力也得到很好的改善。他们认为，表面活性剂通过“有序化”把反应物有选择地聚集在一个有利于反应的“微环境”里，使反应物处于“分子水平”，从而改变了氢化物发生的动力学反应过程，促进了氢化物的生成。而Bonilla等[25]发现少量过渡元素镍、钴、锰的存在使HG-AFS中铅的灵敏度明显增加，并将此应用于生物样品中微量铅的测定。Bonilla等认为，镍对铅氢化物信号的这种影响可能是由于极不稳定的镍的氢化物瞬时地参加反应，从而促进了铅氢化物的生成。然而对于有机试剂、表面活性剂、过渡金属离子等的增敏机理研究还比较薄弱，它们在蒸气发生效率方面的研究前景潜力很大。本实验室在大量试验的基础上，建立了十二烷基磺酸钠对锡增敏效应的新方法。
2.2元素的形态与价态分析
“形态分析”最早是由URE[26]提出来的，它是分析化学的一个重要领域，它对揭示微量元素在环境中的迁移转化规律及其生物化学作用具有重要意义。不同元素形态具有不同的环境化学和生物行为，元素毒性也与其存在形态有关。
Stemmer[27]等首先指出无机锑的毒性大于有机锑，三价锑的毒性是五价锑的 10 倍。此后，文献[28]指出海洋中锑的形态主要是甲基锑；文献[29]指出海产品中砷的存在形式主要是砷甜菜碱（AsB arsenobetaine）和砷胆碱(AsC
arsenocholine)形式存在。Poison[30] 和Zhang[31]进一步指出无机砷的毒性最大，甲基砷的毒性较小，而 AsB 和AsC常被认为是无毒的。Dodd[32]等则研究了水生物中锑的形态；Burlo[33] 和 Car，bonell-Barrachina[34]报道了不同形态的砷化合物对农作物生长及产量有明显的影响；进一步拓展了有害金属元素在环境中的应用。Agget和 Aspel[35]对不同价态的砷发生氢化物的机理进行了解释，指出由于三价砷和五价砷被NaBH4还原的速率不同，导致了不同的氢化物发
生条件，Andreae[36]等则认为氢化物发生的效率依赖于一定的pH值，三价砷锑和五价砷锑还原反应的发生是在一定的pH值范围内，在适当的酸度范围内三价和五价砷锑均可发生反应，也可以有选择性的进行反应。另外研究还表明，选用不
同的介质也可以有选择性的进行形态分析，Yamamoto[37]等采用柠檬酸介质、Campbell和 Howard[38]采用醋酸-醋酸钠介质、Nakahara 和 Kikui[39]采用苹果酸和酒石酸介质各自进行了锑的形态分析；在柠檬酸、苹果酸、醋酸等介质中进行砷的形态分析亦有报道。Rondon[40]等进一步指出在无机酸介质中，三价砷的信号随酸度的降低迅速降低，而在有机酸介质中，随酸浓度的降低三价砷的信号下降幅度不大。
所有这些研究表明对有害金属元素的形态分析已取得较大进展，但是仍有一些问题亟待解决：缺少标准物质是元素形态分析的一个共同问题；其次对于环境样品，尤其是固体样品一些元素的提取率偏低，因此进一步提高各形态的蒸气发生效率和研究在氢化物发生前的预富集和提取技术显得非常迫切。本实验室分别采用索氏萃取技术和超声波辅助提取技术实现了对五种中草药中的砷锑价态及分布特征以及枸杞子中的砷、硒形态分析。
二 : 荧光光谱分析讲义0352
理解分子荧光分析的基本原理
理解激发光谱发射光谱 同步光谱 三维荧光光谱的含义
掌握分子荧光发射光谱的特性
了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用
掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素
了解光谱分析法的应用范围
第一章 分子荧光光谱分析
1概述
分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6 S）停止;
当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10 S）;
磷光和荧光的发光机理是不同的。
由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。
2荧光分析的原理
2.1分子荧光发生过程
2.1.1荧光与磷光
2.1.1.1 分子的电子能级与激发过程
分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。.
.
图1 分子电子能级，振动能级和转动能级示意图
室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能， 光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。
每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0 S1 Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。
电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。
电子能态的的多重性用M= 2S+1表示 , S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1
。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量
最低的各个轨道中。根据Pauli不相容原理,一个给定轨道中的两个电子，必定具有相反方向的自旋，即自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数S=0，就是说基态没有净自旋。分子的多重度M=1，该分子体系便处于单线态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单线态的。
基态分子在吸收光能后其价电子从成键轨道或非成键轨道跃迁到高能量的反键轨道上，产生激发态分子，此为分子光吸收过程。但是激发态分子不稳定，通常很快失去能量回到基态。如果激发态分子在返回基态时以光辐射的形式失去能量，这种光辐射过程叫做光致发光。分子吸收能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变，这时分子处于激发的单线态。分子吸收能量后如果电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子。即S=1，分子的多重度M= 2*1+1=3，这时分子处于激发的三线态，用符号T表示。处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋比成对自旋更稳定些（洪特规则）。因此三线态的能级总是比相应的单线态能级略低。
单线基态 激发单线态 激发三线态
图 2 单线态和三线态
2.1.1.2 荧光的产生
根据波滋曼分布(Boltzmann distribution ) 分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单线态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁率, 不能直接跃迁到激发三线态的振动-转动能级。处于激发态的分子是不稳定的，
它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等多种
分子内去活化过程释放多余的能量而返回基态，发射荧光是其中途径之一。下面几种方式为基本去活化过程；
振动弛豫：(VR vibrational relaxation ) 在溶液中的物质分子受入射光激发后形成的激发态分子，通过与溶剂分子碰撞，将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回同一电子激发态的最低振动能级。在这个过程中，分子被激发时吸收的能量不是以发出光辐射的形式耗散，因而属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级进行，所需时间约为10-8秒数量级。
内转换：(IC Internal conversion): 指相同多重态电子能级中等能级间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子激发态之间能量相差较小，以至其振动能级有重叠时，则可能发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低电子能级的激发态。上述的振动能级之间很接近时，内部能量转换容易发生。
外转换（Ecexternal conversion）： 溶液中激发态分子与溶剂分子及其他溶质分子之间发生碰撞而消耗能量，所消耗的能量转换为热能。外转换常发生在第一激发单线态或第一激发三线态的最低振动能级向基态转换的过程中。转换时间为10-9---10-7秒，其发生可以降低荧光强度，这一现象叫荧光熄灭或猝灭。
系间跨越 (Intersystem crossing, ISC)： 系间跨越指不同多重度状态之间的一种无辐射跃迁过程。它涉及到受激电子自旋状态的改变S1?T1，使原来两个自旋配对的两个电子不再配对，这种跃迁是禁阻的，但如果两个电子的能级的振动能级有较大的重叠时，例如激发单线态S1的最低振动能级与激发三线态T1的较高振动能级重叠, 则可能通过自旋-轨道耦合等作用使S1态转入T1态的某一振动能级.。系间跨越可以使荧光强度减弱或熄灭。
荧光发射： （Fluorescence emission）.当分子被激发到任意一个激发单线态，并通过内转换及振动弛豫返回到第一激发单线态的最低振动能级后， 再以辐射形式发射光量子并返回到基态的各个不同的振动能级上，在这个过程中发射的光量子即称作荧光。由于从较高的激发态的振动能级返回到第一激发单线态的最低 振动能级耗散了部分能量，荧光的能量小于激发光能量，所以发射荧光的波长比
激发光的波长要长。发射荧光的过程约需10-9—10-7秒，电子返回到基态时可以停留在基态的任意振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个互相靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子很快回到基态的最低振动能级。根据kasha 规则，荧光多为S1?S0跃迁。
荧光产生的过程和条件：
荧光物质产生荧光的过程可以分为4个步骤
1 处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线的照射，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，跃迁到第一电子激发态的各个振动能级；
2被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，返回到第一电子激发态的最低振动能级；
3返回到第一电子激发态的最低振动能级的分子继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，这就是荧光；
4 到达基态的各个不同振动能级的分子，再通过无辐射跃迁最后返回的基态的最低振动能级。
磷光发射 激发态分子通过振动弛豫下降到第一电子激发态的最低振动能级后，有可能经过体系间跨越转移到激发三线态的高振动能级上。从单线态到三线态的分子系间跨越跃迁发生后，接着发生快速的振动弛豫而达到三线态的最低振动能级上。分子在三线态的最低振动能级可以停留一段时间，然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射叫磷光。
磷光与荧光的根本区别是荧光是由激发单线态最低振动能级至基态各振动能级间跃迁产生的。由于激发三线态的最低振动能级比激发单线态的最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。从紫外光照射到发射荧光的时间约为10 –8秒～10 –5秒，而发射磷光则更迟一些，约在照射后10 –4秒～10秒。
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
图 2 荧光的产生
2.1.2分子荧光的激发光谱与发射光谱
任何荧光化合物都有两个特征光谱： 激发光谱和发射光谱，这是定性和定量分析的基本参数和依据。
激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发波长。这可由激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时选择荧光的最大发射波长为测量波长，改变激发光的波长，测定荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样，这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。
区别在于紫外吸收光谱测定对紫外光的的吸收度，而荧光激发光谱测定发射的荧光强度。
发射光谱： 简称荧光光谱。将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度得到荧光发射光谱。
图3 是室温下蒽在环己烷溶液中荧光激发光谱和发射光谱。
从图中可见在蒽的激发光谱中350nm 激发峰处有几个小峰，这是由于吸收能量后由基态跃迁到第一电子激发态中各个不同振动能级引起的。在蒽的发射光谱中也有几个小峰，这是由于蒽分子从激发态中各个不同振动能级跃迁到基态中不同振动能级发射出的荧光量子的能量不同引起的。
2.1.3荧光光谱的特征：
2.1.3.1 Stockes位移
在溶液荧光光谱中观察到的荧光发射光波长总是大于激发光波长，Stockes 1852年首先观察到这种波长移动现象，因而称之为Stockes位移。
激发峰位和发射峰位的波长差称为Stockes位移，它表示分子回到基态之前，在激发态寿命期间的能量消耗。用公式表示如下：单位是cm-1
Stockes位移=10 7(1/?ex -1/?em)
?ex ?em 分别为校正后的最大激发波长和发射波长。
Stockes位移说明在激发和发射之间存在着一定能量损失，激发态分子通
过内转换和振动驰豫过程迅速到达第一激发单线态的最低振动能级，这是产生
Stockes位移的主要原因。
激发态分子与溶剂分子的碰撞也造成能量损失，加大了Stockes位移。
2.1.3.2荧光发射光谱的形状与激发波长无关
原因：荧光分子吸收了不同波长的激发光后可被激发到不同能级，然后通过振动弛豫和内部能量转换, 最终都将回到第一激发单线态的最低振动能级，再发射荧光。因此荧光发射与荧光物质的分子发射到哪个能级无关，即与激发能量无关。一般说来， 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关，激发电子都是从电子第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发射光谱的形状与激发波长无关。
2.1.3.3 荧光光谱与激发光谱的镜像关系
荧光物质的荧光发射光谱与激发光谱存在着近似的“镜像对称”关系。图 3是蒽的荧光激发和发射光谱图.。 蒽的荧光激发光谱左边灰色图谱有一个a峰它是由分子吸收光后能后从基态S0跃迁到第二电子激发态S2形成的。在高分辨率的荧光光谱图上可以观察到B0 b1、b2、b3、b4 、等小峰组成的一蔟，他们分别由是由分子吸收光能后从基态S0跃迁到第一电子激发态S1的各个振动能级形成的（见光谱图上方与之对应的能级示意图）。各小峰间波长递减值??与振动能级差??有关，各个小峰的高度与跃迁几率有关（b1的跃迁几率最大，b0次之，b2、b3、b4依次递减。蒽的荧光发射光谱（右边黑色图谱）同样包含C0、C1、C2、C3、C4 一蔟小峰, 他们分别由分子从第一电子激发态S1的最低振动能级跃迁至基态S0的各个振动能级发出光辐射形成的。由于电子基态的振动能级分布与与激发态相似但不相同 , b1峰与 c1 峰b2峰与c2峰都是以 ?b2 为中心基本对称。再加上C0、C1、C2、等峰的高度也与跃迁几率有关，c1的跃迁几率最大，c0次之，c2、c3、c4依次递减.）因此形成了激发光谱和荧光发射光谱的对称镜像现象。
2.2荧光与分子结构的关系
荧光与分子结构的关系是一个比较重要问题，弄清他们之间的关系可以预示分子能否发生荧光，在什麽条件下发生荧光。这对研究分子荧光分析的应用很有
意义。
2.2.1荧光寿命与荧光效率
荧光寿命与荧光效率是荧光物质重要的发光参数
荧光寿命Fluorescence life time)：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间称为荧光寿命。常用?f。表示。当荧光物质受到一个极短的光脉冲激发后，它从激发态跃迁到基态的变化可用指数衰减规则表示：
Ft=F0e-Kt.
式中F0， ，Ft 分别是在激发开始t=0和激发后时间 t 的荧光强度，K是衰减常数。假定在时间t=?f 测得得荧光强度 Ft 为F0 的1/e ，即Ft=1/e F0， 根据上述公式，1/e F0 = F0e-K?f ， 由此得到
1/e= e-K?f
K?f=1，
K=1/?f
所以上述公式可以写成Ft= F0e-K?f 或者 Ln F0/Ft = t/?f
如果以Ln F0/Ft对时间t作图 ，直线斜率即为1/?f。由此可以计算出荧光寿命。利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光混合物的分析。
荧光效率（Fluorescence Efficiency）：又称为荧光量子产率(Fluorescencequantum yield)；是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，它表示物质发射荧光的能力。通常用下式表示?f
?f = 发射荧光的光子/吸收激发光的光子
= Kf/( Kf + ∑Ki )
Kf 荧光发射过程的速率常数，
∑Ki 为其他有关过程的速率常数之和。
许多物质并不发射荧光，因为在激发态分子释放激发能的过程中除了荧光发射外，还有许多辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。
如果在受激分子回到基态过程中没有其它去活化过程与荧光发射过程进行
竞争，那麽在这一段时间内，所有激发态分子都将以发射荧光的方式回到基态，这一体系的荧光效率等于1。事实上，任何物质的荧光效率不可能等于1，而是在0~1 之间。例如一些被作为荧光标准物质的9-氨基口丫啶（在水中），为0.99；蒽在乙醇中为0.30 ;硫酸奎宁二水化合物（在0.5 mol/l硫酸溶液中）为0.55。
荧光效率低的物质即使有较强的紫外吸收，所吸收的能量都以无幅射跃迁形式释放，内转换外转换的速度很快，所以没有荧光发射。
2.2.2分子结构与荧光的关系
2.2.2.1物质分子产生荧光的条件
物质分子产生荧光必须具备两个条件；
1物质分子必须具有与照射的辐射频率相适应的吸收结构，才能吸收激发光；
实验表明，分子结构中含有???*跃迁或n??*跃迁的化合物都有紫外可见吸收，但n??*跃迁引起的R带是弱吸收带，电子跃迁几率小，由此引起的荧光很弱。所以实际上只有分子结构中存在???*跃迁，也就是K带强吸收时才可能有荧光发生。
2 吸收了与其本身特征频率相同的能量后必须具有一定的荧光量子产率。
2.2.2.2分子结构与荧光性质
荧光通常发生在具有共轭双键体系的分子中。能产生荧光的分子都具有共轭双键和大?键。
长共轭结构
绝大多数荧光物质都含有芳环或杂环，因为具有这些结构的分子具有长共轭的???*跃迁。?电子的共轭程度越大，荧光强度越大，而荧光波长也将红移。如苯萘蕙三个化合物的共轭结构与所发射的荧光的关系如下 ：
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
苯 萘 蕙
?ex 205nm 286 356
?em 278 321 404
?f 0.11 0.29 0.36
除了芳香烃外，含有长共轭双键的的脂肪烃也可能有荧光，但这一类化合物的数目不多。维生素A是能够发射荧光的脂肪烃之一。
分子的刚性和共平面性
在同样的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越大，荧光效率越大，且荧光波长产生长移。例如，在相似的测定条件下，联苯和芴的荧光效率分别为0.18 和1，芴的分子中亚甲基使其分子的刚性增加，两个苯环不能自由旋转，共轭电子的共平面性增加，使芴的荧光效率大大增加。导致两者的荧光性质有显著差别。
C
H2
联苯 芴
同样情况还有酚酞和荧光素。他们分子中共轭双健长度相同，但荧光素分子中多一个氧桥，使分子中三个环成一个平面，随着分子刚性和共平面性增加，?电子的共轭程度增加，因而荧光素有很强烈的荧光，而酚酞的荧光则很弱。
不发生荧光或发生较弱荧光的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性和共平面性增强，那麽就可以发生荧光或荧光增强。如 8-羟基喹啉是弱的荧光物质，与镁，铝离子形成配位化合物后，荧光就增强。
Mg 2+
NOH8-羟基喹啉 8-羟基喹啉镁配合物
如果原来结构中共平面性较好，但分子中取代了较大的基团，由于位阻的原因使分子的共平面性下降，则荧光会减弱。例如：1-二甲氨基萘-8-磺酸盐的
?f = 0。03，而2-二甲氨基萘-8-磺酸盐的?f = 0.75, 这是因为二甲氨基与磺酸盐之间的位阻效应，使分子发生了扭转，两个环共平面性变差，结果荧光减弱。
CH3
SO3NaCH3O3NaH3NCH3
结构式 结构式
2-二甲氨基萘-8-磺酸钠 1-二甲氨基萘-8-磺酸钠
?f = 0.75 ?f = 0.03
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一侧，由于位阻效应使分子不能公平面而没有荧光。例如 1，2 二苯乙烯的反式异构体就有强烈荧光，而其顺式异构体就没有荧光发射。
取代基效应
荧光物质分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都会产生很大的影响。取代基可以分为3类：
第一类取代基 为给电子基团：包括 —OH、 —OR、 —NH2、 —CN、 —NR2等使荧光增强。这是因为产生了P—?共轭作用，增强了?电子的共轭程度，使最低激发三线态与基态之间的跃迁几率加大的缘故。
第二类取代基 为吸电子基团：如 —COOH， —C=O， —NO2, —NO, —SH , —NHCOCH3, —Cl, —Br,—I ，由于减弱了分子?电子的共轭程度，从而减弱甚至猝灭荧光。
第三类取代基：对电子的共轭作用较小对荧光影响不明显。如—R —SO3H， NH3 。
表1 列出了部分取代基对苯的荧光效率和强度的影响.
表 1 苯环取代基在乙醇溶液中的荧光相对强度
化合物 分子式 荧光波长 荧光相对强度
苯 C6H6 270-310 10
甲苯 C6H5CH3 270- 320 17
丙基苯 C6H5C3H7 270- 320 17
氟代苯 C6H5F 270-320 10
氯代苯 C6H5Cl 275-345 7
溴代苯 C6H5Br 290-380 5
碘代苯 C6H5I -- 0
苯酚 C6H5OH 285-365 18
酚离子 C6H5O+ 310-400 10
苯甲醚 C6H5O- 285-345 20
苯胺 C6H5 NH2 310-405 20
苯胺离子 C6H5NH3+ -------- 0
苯甲酸 C6H5 COOH 310-390 3
苯基氰 C6H5CN 280-360 20
硝基苯 C6H5NO2 ------------- 0
------------------------------------------------------------------------------------------------------- 取代基位置对应光强度有影响。对芳烃而言，一般邻位对位取代基增强荧光。间位取代基抑制荧光（—CN例外）。当取代基存在使共轭增加时，取代基影响下降。当两个取代基共存，可能其中一个起主导作用。重原子取代基存在如I则会使荧光减弱。这是因为重原子的存在，使荧光体的电子自旋-轨道耦合作用加强，S1 ? T1间的跨越显著增强的缘故。
-
2.3影响荧光强度的外部因素
分子所处的外界环境如温度、溶剂、酸度、荧光猝灭剂等，都能影响荧光效率，甚至影响分子结构及立体构象，从而影响荧光光谱的的形状和强度。了解和利用这些因素的影响，有助于提高荧光分析的灵敏度和选择性。
2.3.1 温度
温度对荧光强度影响敏感。在一般情况下，随着温度的升高，溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低。因为当温度升高时分子运动速度加快，分子间碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，从而降低了荧光强度。例如荧光素钠的乙醇溶液在零度以下温度每下降10度，?f增加3%，在零下80度时?f接近1。
2.3.2溶剂
溶剂的影响分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应指溶剂的折射率和介电常数的影响 。特殊溶剂效应指荧光体和溶剂分子之间的特殊化学作用，如氢健的形成和化合作用。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则取决于溶剂和荧光体的化学结构.。特殊溶剂效应大于一般溶剂效应的影响。同一荧光物质在不同溶剂中，其荧光光谱形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随溶剂的极性增大而红移，荧光强度增强。因为在极性溶剂中，???*跃迁所需的能量差?E减少，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均红移，荧光强度增大。
溶剂粘度减少，分子碰撞机会增加使无辐射跃迁增加 而荧光减弱，故荧光强度随溶液的黏度降低而减弱。一般温度上升，溶剂黏度变小，因此温度上升荧光强度下降。
2.3.3溶液的pH
当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对荧光物质分子的荧光强度有较大的影响。这是因为其分子结构和离子结构是不同的，它们的电子构型不同，在不同的酸度条件下分子和离子之间的平衡发生改变，因此荧光强度发生改变 。每一种荧光物质的分子都有其最适宜的发射荧光的存在形式，即最适宜的pH 范围 。在pH 7-12 的溶液中， 苯胺以分子形式存在，会发生兰色荧光，但在pH〈2 或 〉13的溶液中苯胺以离子形式存在不发生荧光。
金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受溶液pH值的影响。一方面pH
值会影响螯合物的形成，另一方面也影响螯合物的组成，因而影响他们的荧光性质。例如镓与2，2’—二羟基偶氮苯在pH 3-4的溶液中形成1：1的螯合物，能发射荧光。而在pH 6-7的溶液中则形成非荧光性的1：2型螯合物。
2 3 4溶液荧光的猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象叫荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质叫猝灭剂。
荧光猝灭的形式：
碰撞猝灭：是荧光猝灭的主要类型。处于激发单线态的荧光分子M*与猝灭剂分子Q相碰撞，使荧光分子以无辐射跃迁的形式回到基态，产生猝灭作用。这一过程可以表示如下：
碰撞猝灭
M+ h? ? M*
?M+h?’ (发生荧光)
?M (非辐射猝灭)
?M+Q （碰撞猝灭）
静态猝灭：
由于部分荧光物质分子M与猝灭剂分子Q 生成了本身不发生荧光的的配位化合物而产生。这一过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。
转入三线态猝灭：
在荧光物质分子中，引入溴和碘后易发生体系间跨越，而转变为三线态。转变为三线态的分子在常温下不发光，他们在与其它分子碰撞中消耗能量而引起荧光猝灭。
溶解氧引起的荧光猝灭：
溶解氧的存在使荧光物质氧化，或者由于氧分子的顺磁性，促进了荧光物质激发态分子体系间跨越跃迁，使激发单线态的荧光分子转变至三线态，从而引起荧光熄灭。
发生电子转移反应的荧光猝灭：
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用发生了电子转移反应，引起荧光猝灭。如甲基蓝溶液的荧光被Fe2+ 离子猝灭就是这种情况。其他的I- 、Br—、 CNS-— 、S2O32- 等易给出电子的阴离子，对奎宁，罗丹明及荧光素钠的物质的荧光也会发生猝灭作用。
荧光物质的自猝灭：
在浓度较高的荧光物质溶液中往往会发生自猝灭现象。其原因是单线激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光分子碰撞引起自熄灭，如蒽和苯。有些荧光物质分子在溶液浓度高时会形成二聚体或多聚体，使其吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。解决方法： 稀释样品； 标准加入法。 2.3.5散射光的干扰
当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。
瑞利散射：当光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量交换，仅仅是光子的运动方向发生改变，这种散射叫瑞利散射光。其波长与入射光波长相同。 拉曼散射：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量交换。光子把部分能量转给物质分子后，在一定条件下，分子所获得的能量使得围绕其中某一健分布的电子云产生瞬时弹性变形，这时辐射能量暂时保留在变形的极化分子的一个虚态上。这个虚态并不存在常规电子能级图中，电子在那里只能保持10-15-10-14秒时间，随后回到其电子能态基态的不同振动能级上，发射出比入射波长长或稍短的光，称为拉曼光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，因为一般同时产生的多条拉曼辐射线，可以复合成一个覆盖一定波长范围的较宽的带，如果这种辐射带正好和荧光辐射的波长相近，就会对荧光测定产生干扰。因此在荧光测定中必须采取措施避免这种干扰。
选择适当的激发波长可以消除拉曼光的干扰。以硫酸奎宁为例。从图4可见，无论选320nm或者350nm 为激发光,荧光峰总是在448 nm。分别在320nm和350nm激发光下测定空白溶剂的发射光谱， （这种情况下并没有发生荧光发
射，得到的是拉曼散射光）。从图b 可见， 当激发波长为320 nm 时瑞利光波长是320 nm ，拉曼光波长是360 nm ，拉曼光对荧光无影响；。当激发波长为350 nm 时瑞利光波长是350 nm ，拉曼光波长是 400 nm ，拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。
图4 硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
水， 乙醇，环己烷，四氯化碳，氯仿这5种溶剂是最常用的溶剂，他们自身都能发射拉曼散射光，从而可能干扰荧光测定。表2 列出了不同波长激发光照射下的拉曼辐射波长，可供选择激发波长或溶剂时参考。
表2 不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长
溶剂 激发波长
248 313 365 405 436
------------------------------------------------------------------------------------------------------- 水 271 350 416 469 511
乙醇 267 344 409 459 500
环己烷 267 344 408 458 499
四氯化碳 -- 320 375 418 450
氯仿 -- 346 410 461 502
2.3.6 内滤光作用和自吸收现象
溶液中如果存在着能吸收激发或荧光物质所发射的光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用“。例如在1ng/ml的色氨酸溶液中如果有重铬酸钾存在，由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是重铬酸钾的两个吸收峰，吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光，使测得的色氨酸荧光大大降低。
内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与与该物质的吸收光谱的长波长的一端有重叠。
在溶液浓度较大时一部分荧光发射被自身吸收，产生所谓自吸收现象，降低了溶液的荧光强度。
3定量分析方法
3.1强度与浓度的关系
由于荧光物质是在吸收光能被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。溶液中荧光物质被入射光（I0）激发后可以在溶液的各个方向观察荧光强度（F）。.但由于激发光有部分透过（I），这部分透过的入射光会干扰对荧光的测定，因此应该在与激发光源垂直的方向进行测定。设溶液中荧光物质的浓度为C，液层厚度为L，荧光强度F正比于被荧光物质吸收的光强度，即：
F ? (I0— It) ，F ? Ia
F= K’ Ia, 公式中K’为常数, 其数值取决于荧光效率。
根据Lambert –Beer定律
Ia= I0 —It=I0 (1—10-ECL) = I0 (1—e -2.3ECL)
e -2.3ECL =1+ (-2.3ECL)1/1! +(-2.3ECL)2/2!+(-2.3ECL)3/3! +(-2.3ECL)4/4!+…….. 若浓度很小，ECL值也很小，ECL<0.05时 ，式中第二项以后的各项可以省略，
于是
e -2.3ECL =1— 2.3ECL
F = K’ Ia = K’ I0 (1—e -2.3ECL)
= 2.3 K’ I0 ECL
当入射光光强度和液层厚度一定，上式简写为
F= KC
在低浓度时溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。荧光分析方法定量的依据是荧光强度与荧光物质的浓度的线性关系，而荧光强度的灵敏度取决于检测器的灵敏度，即只要改进光电倍增管和放大系统使极弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液的浓度，因此荧光分析法的灵敏度很高。
3.2定量分析方法
标准曲线法：浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制工作曲线，在同样实验条件下测定样品溶液。
在绘制工作曲线时常采用系列中某一个标准溶液作为基准，将空白溶液的荧光强度读数调到0% 将该标准溶液的荧光强度调到100%或50%。在实际工作中当仪器调零之后先测定空白溶液的荧光强度，然后再测定标准溶液的荧光强度, 从后者减去前者即可, 然后绘制标准曲线。
为了使在不同时间所绘制的标准曲线能够一致，在每次绘制曲线时均采用同一个标准溶液对仪器进行校正。如果试样在紫外光下不稳定，可以改用另一种稳定的标准溶液作为基准，只要其荧光峰和试样溶液的荧光峰相近似，例如测定维生素B1时，可采用硫酸奎宁作为基准。
在使用工曲线法定量时须注意
荧光分析所用的试剂标准品一定要纯，样品池要清洁。
被分析的样品不能用激发光长时间照射，以免荧光物质发生分解。
标准溶液样品溶液应该在同一条件进行测定荧光强度。
荧光猝灭法； 在一般荧光分析方法中一些荧光猝灭剂应该事先分离。但也可以利用猝灭现象用于荧光分析。若某一物质本身不会发射荧光，也不与其他物质形成荧光物质，但他们会使另一种发射荧光的物质荧光强度下降，下降程度与该物质的浓度成比例，以次建立的荧光分析方法叫荧光猝灭法。例如氟离子会使铝-八羟基喹啉洛和物的荧光强度下降，在适当条件下荧光强度与氟离子的浓度成反比例，可用于痕量氟的测定。
动力学荧光分析法
化学反应时其中反应物或产物中有荧光物质，随着反应的进行，因为浓度变化引起荧光强度随时间的变化，可以求出物质的含量，以此建立动力学荧光分析法。
例如Fe(III) pH=3.4时，1，4二氨基-2，3二氢蒽醌（A）与其发生氧化还原反应，产生深绿色荧光产物（B）, (?ex =400nm, ?em= 470nm), 反应式
Fe(III) + H+ +A Fe(II) + B
当pH值一定时
d[B]/dt = ?[A] [Fe(III)]
式中t 为时间； ?为比例常数。在反应初期可以认为[A]不变，并对上式进行积分，则
[B]= ?? ‘[Fe(III)]t
又由于IFB = k[B]， 公式中IFB为荧光物质的发射强度，则有
IFB = ?? [Fe(III)] t
或 IFB /t= ?? [Fe(III)]
通过测量不同[Fe(III)]下的标准系列浓度，由[Fe(III)]对IFB /t作图，得到工作
曲线。
如果有些化学反应的产物虽能够产生荧光但反应进行缓慢，而在加入某些微量金属离子的催化作用下，反应速率加快，荧光强度随之增强，那麽反应速率与该痕量金属离子浓度存在着定量关系，以此可以测量作为催化剂的痕量金属，此法成为催化荧光测定方法。
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
直接比较法
也叫比例法。如果荧光分析方法的标准曲线通过原点，就可以选择其线性范围，用比例法进行测定。取一个标准溶液使其浓度在线性范围内,测定其荧光强度Fs。之后在同样条件下测定试样溶液的荧光强度Fx， 然后计算物质的含量。空白溶液的荧光强度调不到0%，必须从标准和试样的值扣除空白溶液的荧光强度F0，然后计算。
Fs —F0 =K Cs
Fx — F0 =K Cx
对于同一荧光物质，常数K相同
（Fs —F0 ）/（Fx — F0）= Cs /Cx
Cx =（Fx — F0）/（Fs —F0 ）* Cx
多分混合物分析.:
如果不同组分的荧光光谱相互重叠可以考虑利用荧光强度的加合性质在适宜的波长处测定混合物的荧光强度，再根据被测各个组分的各自在适当的荧光波长处的荧光强度 列联立方程求出各自含量。
导数荧光光谱分析法
也叫微分荧光光谱分析法，用物质荧光强度对对其荧光波长的导数值与其对应波长作图可得导数荧光光谱。
dI/d?— ? 曲线 一阶导数荧光光谱
随着导数阶数的增加，荧光峰的尖锐程度增大，带宽减少，分辨率提高。将靠的很近的，重叠的荧光峰分别开来，还可以清楚地辨认陡坡上的弱小峰肩蜂，宽峰可以准确给出峰位。提供更多的结构信息，用于定性。用荧光导数值与样品浓度值呈线性关系可以用导数荧光光谱分析法定量。
4荧光分析方法的特点
灵敏度高 与紫外可见分光光度法法比较,荧光是从与入射光成直角方向检测，即在黑背景下（有很小的噪声背景）检测荧光发射信号。所以可以用增强入射光强度或增大荧光放大倍数来提高灵敏度；在吸收光度法中不但要测定透过试
样的光强度I，还要测量入射光强度I0. 当试样浓度很低，吸收微弱，I 和I0非常接近，检测器很难区分两个较大信号之间的微小差别。此外在分光光度法中如果增加入射光强度I0，I也按比例变化，若提高检测器信号的放大倍数，其放大作用I0和I是同样的。因此荧光分析的灵敏度要比分光光度法光高2-4个数量级。测定下限在0.1-0.001ng/ml之间。紫外可见分光光度法的灵敏度为10-7g/ml 而荧光光度法测定的灵敏度在 10-10 –10-12g/ml之间。
选择性好 既可根据特征发射又可以根据特征吸收来鉴定物质。如果某几个物质的发射光谱相似，可以从其激发光谱的差异将其区分开来。而如果他们的吸收光谱相同，则使用发射光谱将其区分。
所需样品量少，方法简便
提供较多的物理参数 可以提供激发光谱，发射光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命，荧光偏振等参数，可以从不同角度反映荧光物质分子的各种特性，并通过这些物理参数得到被研究的物质的更多的信息。
缺点 应用范围不够广泛，本身能够发射荧光的物质较少，加入某种试剂经衍生化后才能测定的物质也不是很多。
由于荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素敏感，干扰因素较多。如温度 溶剂，酸度，散射光等。
5 荧光分析仪
5．1 仪器组成
用于荧光测定的仪器由以下四个部件组成： 激发光源；样品池，单色器，检测器（图 5）。由光源发出的光经过第一单色器得到所需要的激发光波长，激发光通过样品池，荧光物质被激发后发射荧光。为了消除入射光和散射光的影响通常在与激发光垂直的方向上测定荧光。为了消除可能存在的其他光的干扰，如激发光产生的反射光，瑞利散射光和拉曼散射以及溶液中杂质产生的荧光，以便获得所需要的荧光，在样品池和检测器之间设置了第二个单色器，荧光作用于检测器上，记录相应的电信号。经过放大被记录下来。
图5 荧光光度计基本组成框图
图6 F-4500荧光光度计光路图
激发光源 在紫外可见光范围， 常用的光源是高压氙灯和高压汞灯。氙灯内装有氙气，氙灯发射的光谱强度大，而且是连续光谱分布在200-700nm 范围内，并且在300-400 波长之间的强度几乎相等。目前大多数荧光计使用它作光源。
高压氙灯是一种气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温下压力0.5Mpa (5 atm) ，工作时压力为2Mpa (20 atm)。氙灯内充气总是处于高压状态先灯寿命约为2000
小时，在安装或更换时要戴上防护镜或者严格按照操作规程进行以便防
止以外发生。由于氙灯的启动电压在 20-40 KV，，不仅人体要注意安全，在仪器配有计算机是，应先点着氙灯带稳定后再开计算机。
样品池 液体样品池通常用石英材料制成，形状以方型或者长方形为好，因为这种形状散射光干扰较少。固体样品用可用样品架。
单色器 包括色散元件和狭缝。较高级的单色器采用光栅。其优点是在所有波长都能够色散而且色散均匀，有相同的分辨率。入射光的80%能量在一级光谱中。第一单色器用于选择所需要的激发波长第二单色器用于分离出荧光发射波长。
狭缝关系到单色器分辨率的优劣， 用于控制谱带宽度和光强度。一般说来，狭缝越窄单色性越好。但光强随之减小而降低灵敏度。在实际使用时应该两者兼顾。
检测器要求有较高的灵敏度，一般应用光电倍增管作检测器。
5．2仪器的校正
灵敏度校正
荧光光度计的灵敏度可以用被检测出的最低信号来表示，通常以硫酸奎宁的检出限或者以纯水的的拉曼峰的信噪比（S/N）表示。
荧光光度计的灵敏度与光源强度，单色器（包括透镜，反射镜）的性能，放大系统的特征，和光电倍增管的灵敏度有关；
与所选用的波长，狭缝宽度有关。
与被测空白溶剂的拉曼散射，激发光，杂质荧光有关。
由于影响因素多，同一型号的仪器，甚至同一台仪器在不同时间操作，所测得的结果也不尽相同。因而在每次测定时，在选定波长和狭缝宽度的条件下，先用一种荧光性质稳定，浓度固定的标准液进行校正，将每次所测得的荧光强度调整到相同数值（50%或100%）。如果被测定的物质所产生的荧光很稳定，自身就可以作为标准溶液。紫外可见范围内最常用的是1?g/ml（0.05mol/l 硫酸中）硫酸奎宁标准溶液。因为其产生的荧光十分稳定。
波长校正
荧光分光光度计的波长出厂前都经过了校正，若仪器的光学系统和检测器有所变动，或较长时间使用后，或在重要部件更换后，有必要用汞灯的标准谱线对单色器刻度重新校正，这一点在要求较高的测定工作中尤为重要。
激发光谱和荧光光谱的校正
荧光分光光度计所测得的激发光谱或荧光光谱往往随着仪器不同而不同。 原因：
单色器波长的准确度，拉曼散射光的影响，以及狭缝宽度等。
其最主要的原因有光源的强度随波长变化 ，检测器对不同波长光的接受敏感程度不同，检测器的响应与光强不成线性。
由于以上原因，在用单光束仪器测定激发和发射光谱时，因为不能用参比溶液进行相对校正，误差较大。尤其是当波长处于检测器灵敏度曲线的陡坡时得到的“表观光谱”中的值之间的相对关系不能反映真实情况，产生了显著误差。因此可先用仪器上附有的校正装置将每一个波长的光源强度调整到一致，然后根据表观光谱每一个波长的强度除以检测器对每一个波长的感应强度进行校正以消除误差。
目前生产的光度计大都是双光束光路，可以用参比光束抵消误差。
5.3 荧光分析仪器的维护
要正确提供主机及附件所需的供电电压和频率，不可接错电源。
拿灯时不要碰窗口，如果不小心碰触，及时用无水乙醇擦净，灯源不稳定或强度太弱而影响测定时，应换灯；
不要用肉眼直视灯源，以免损伤眼睛。
单色器不得轻易拆卸，保持内部干燥，以防色散元件和反射镜受潮。
放样品池时要固定一个方向，免得液池各透光面被池架的弹簧片擦坏，增加散射。液池要洗净，不得留有痕迹影响测定。
新的液池常常挂水，可用3mol/l 盐酸和50%乙醇等量混合液浸泡。
保持光电倍增管室干燥，保证绝缘良好，光电倍增管通电后避免不必要的爆光 要养成随时关闭光闸的习惯，以免损坏光电倍增管，或因为“疲劳”降低灵敏度。
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
5.4 荧光测定物理条件的选择
荧光测定可变因素比较多，只有选好条件才能获得满意的激发和发射光谱。由于样品和仪器各不相同，因此测定条件不能固定不变。应当寻找仪器最佳条件。
灯电流 光源灯电流不能超过测定范围，但为了提高测定灵敏度，可以调节灯电流到最大允许值。
波长扫描范围： 对已知光谱特性的样品，不需进行广泛扫描。在测试一个未知光谱特性的样品的激发和发射光谱时 扫描样品时范围应该宽一些。如扫描发射光谱时，在短波方向应该多扫一些，以观测瑞利散射和喇曼散射的影响。
狭缝宽度 选好激发和发射单色器狭缝单色器宽度，是获得一个好图谱的关键。对定性分析来说，希望窄一些，因为狭缝窄谱带纯，能得到精细的光谱。对于定量测定狭缝小，光强弱，会影响测定的灵敏度和准确性，因而狭缝宽度不能过窄。 样品池：进行精确分析时应该使用正方形池。微量池的优点是样品用量少和克服内滤光效应。缺点是狭缝宽度较大时池壁的散射和反射会进入发射单色器，使空白荧光增加。
光电倍增管的电压： 为了提高测定灵敏度，有时可以把光电倍增管的电压提高到最大允许值。但此时光电倍增管容易疲劳暗电流和噪音会因此增加。另外光电倍增管的灵敏度和波长响应与温度密切相关，因此温度较高时要注意散热。
灵敏度：一般说来，灵敏度越高，所得的荧光强度越大，但仪器噪音和溶液的拉曼光也就越大。有时对于一个稀溶液，为了得到大的荧光强度以准确定量采用大缝宽和高灵敏度，但却会导致散射峰干扰，甚至掩盖了弱小荧光峰。 扫描速度 太快，响应不同步，容易漏掉小峰。
6 荧光分析新技术简单介绍
6.1 激光荧光分析
激光荧光分析采用发射光强度大，波长更纯的激光作光源，该光源大大提高了荧光分析方法的灵敏度和选择性。利用激光光源的相干性可以产生非常理想的辐射，以激光为光源可以使仪器仅仅使用一个单色器，加上利用可调谐激光器的
可调功能获取激发光谱发射光谱。目前，激光诱导荧光分析法已经成为分析超低浓度物质的灵敏而有效的方法。在分析单细胞核内元素时，最小可以测到10-16-10-14g
6.2 时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，可以在激发和检测之间延缓一段时间，使具有不同荧光寿命的物质达到分别检测的目的。这就是时间分辨荧光分析。进行这种测量的具体做法是采用带有时间延迟设备的脉冲光源和和带有门控时间电路的检测器件，从而可对光谱重叠但寿命有差异的组分进行进行分辨和和分别测定。或者是固定发射波长，得到荧光强度随时间的衰变曲线和给定时间出的荧光发射光谱，可用于荧光寿命的测量，溶剂弛豫时间的测量。
时间分辨荧光测定常用的光源是激光器，例如氩离子离子激光器可提供重复频率为76MHz，脉冲宽度为100ps的351 nm激光光束。可调谐染料激光器还可以选择所需要的激发波长。在采用激光光源的时间分辨荧光计中由光束分裂器来的一部分激光，作为外触发信号，利用电子延迟电路选择控制一定延迟时间使盒式积分器门控开门，将样品发射并经光电倍增管放大后的信号输至盒式积分器获取信号。
利用时间分辨荧光分析，如果选择了合适的延缓时间，可以把待测组分的荧光和其他组分或杂质的荧光以及仪器的噪音分开而不受干扰。该法在测定混合物中某一组分时的选择性比用化学法处理样品更好，而且省去前处理的麻烦。
6.3 同步荧光光谱分析
同步荧光分析根据激发单色器和发射单色器在扫描过程中彼此间保持的关系，同步扫描荧光技术可分为固定波长差， 固定能量差，和可变角同步扫描三类。固定波长差方法将激发和发射单色器波长维持一定的差值??，得到同步荧光光谱。这时如果 ?? 相当于或者大于斯托克额斯位移，能够获得尖而窄的荧光峰。荧光物质分子浓度与同步荧光光谱的峰高成线性响应关系。
同步荧光光谱的荧光强度与激发光信号， 荧光发射信号的关系为 ：
当物质的浓度一定时，同步荧光信号强度与所用的激发光谱信号和荧光发射光谱信号的乘积成正比。
Fsp (?em , ?ex) =K C FemFex . K 为常数，C为待测物的浓度。所以此法灵敏度较高。
固定波长差同步扫描中，??的选择直接影响到所得到同步荧光光谱的形状，带宽，和信号强度，从而提供一种提高选择性的途径。
例如，铬氨酸和色氨酸的荧光激发光谱很相似，发射光谱又严重重叠，但???15 nm的同步光谱只显示铬氨酸的光谱特征，???15 nm的同步光谱只呈现色氨酸的光谱特征，从而可以实现分别测定。固定能量差同步扫描和可变角同步扫描技术可以进一步提高选择性和最大限度地减少瑞利散射和拉曼散射的干扰。同步扫描技术具有使光谱简化，使谱带变窄，提高分辨率减少光谱重叠提高选择性，减少散射光影响等优点。
6.4三维光谱扫描
三维光谱可以同时获得激发波长和发射波长同时变化的荧光强度信息。 三维光谱有两种表现形式：等高线图和伪三维投影图。能够获得完整的光谱信息，是一种很有价值的光谱指纹技术 ，在临床中已经用语癌细胞的辅助诊断和不同细菌的表征和鉴别。另外作为一种快速检测技术，对化学反应的多组分动力学有独特的优点，目前采用三维光谱技术进行多组分混合物的定性定量是分析化学热点之一。
图7-三维荧光光谱的两种表示
6.5 胶束增敏荧光分析
胶束增敏是一种可以用来通过提高荧光效率，来提高荧光分析灵敏度的化学方法。20世纪40年代起人们就观察到胶束溶液对荧光物质有增溶，增敏，增稳作用，70年代后期人们将这种效应用于荧光分析，发展成为胶束增敏荧光分析法。胶束溶液是是具有一定浓度的表面活性剂溶液。表面活性剂的化学结构都具有一个极性的亲水基团和一个非极性的疏水基团。。在极性溶剂中（水）几十个表面活性剂分子聚合成团，将非极性的疏水基尾部靠在一起，形成疏水基向内，亲水基向外的胶束。
溶液中胶束数量开始明显增加时的浓度，成为临界胶束浓度，
低于临界胶束
浓度溶液的表面活性剂分子基本以非缔合形式存在，超过临界浓度浓度后，再增加表面活性剂的量，非缔合分子的浓度增加很慢，而胶束数量的增加和表面活性剂浓度的增长基本呈正比。
胶束溶液对荧光物质分子的增容作用是因为非极性的有机物与胶束的非极性尾部有亲合作用使荧光分子定位与胶束的脂性内核中这对荧光分子起到一定的保护作用，减弱了荧光质点之间的碰撞，减少了分子之间的无辐射跃迁，增加了荧光效率，从而增加了荧光强度。这就是胶束溶液对荧光的增敏作用。
此外，胶束溶液提供了一种对激发单线态的保护性环境，荧光物质被分散和定域于胶束中，得到了了有效屏蔽，即降低了溶剂中可能存在的荧光猝灭剂的猝灭作用，也降低了因光物质因为自身浓度太大产生的自猝灭，从而延长了荧光物质的寿命。这就是胶束溶液对荧光的增稳作用。由于胶束溶液增稳和增敏作用，胶束溶液作为荧光介质可以大大荧光分析方法的灵敏度和稳定性， 从而发展了分子荧光分析新技术。
6.6 荧光偏振（polarizer）及各向异性 (anisotropy ) 测量
在荧光光度计的激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器，即可仪对检偏器的取向平行或或垂直于起偏器的取向的情况下分别观察到荧光强度。。荧光偏振不仅与荧光体分子形状荧光物质吸光对偏振激发的取向，光选择性以及与激发矩和发射距是否为共线的共振偶极体有关，而且许多外界因素，如环境的黏度等都会影响和改变其偏振度，从而在生物化学领域获得广泛应用。例如已经用于确定生物分子间的缔合反应量，膜内微黏度膜组成对膜相变的影响。荧光体的偏振度与荧光体的转动速度成反比这一特性，可用于荧光免疫分析中。例如，当小分子荧光体被联结到大分子蛋白质或抗体后，由于体积变大，分子转动速度变慢，偏振度增大。若样品中存在小分子抗原，则连接于抗体上的荧光体可能被抗原夺走，结果偏振度下降，从而可用于抗原或抗体的测定。
7应用
7.1 有机化合物的测定
有机化合物中脂肪族化合物分子结构简单，能够产生荧光的为数不多。芳香
荧光光谱分析讲义0352_荧光分析
族化合物及具有芳香结构的化合物，因为存在共轭体系而容易吸收光能在紫外光照射下很多能够发射荧光。能用荧光法测定的有机化合物包括多环胺类，萘酚类，嘌呤类，吲哚类，多环芳烃类具有芳环或芳杂环结构的氨基酸及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱麻黄硷，吗啡，喹啉类，异喹啉类生物碱等，抗生素类， 青霉素四环素；维生素类如维生素A ，B1, B2, B6,B12， E, 抗坏血酸，叶酸，及烟酰胺等。此外中草药中的许多有效成分都能产生荧光，可以用荧光分析法进行初步鉴别和含量测定。
20世纪50年代后期，分析工作者开发了许多适用于各种重要天然化合物荧光分析的衍生化方法。
以下是几种重要的衍生化试剂。
荧光胺 能够与脂肪族或芳香族伯胺类形成荧光衍生物。
邻苯二甲醛 在二巯基乙醇存在下，在pH 9-10 的缓冲液中, 邻苯二甲醛能与伯胺类除了半胱胺酸，脯氨酸，羟脯氨酸外的 ?-氨基酸生成灵敏的荧光产物。 丹酰氯 可与伯胺仲胺及酚基生物碱类反应生成荧光产物。
7.2 无机物的荧光分析：
无机离子中除了铀盐等少数离子外，一般不显荧光。
一些反磁性的金属离子和有机的配体生成荧光螯合物可以成为分析这些金属离子的灵敏和选择性的方法。能用这种方法测定的金属离子有Al、Au、 B、Be、Ca、Cd 、Cu、Eu、,Ga、Gd、Ge、Hf、、Mg、Nb、Rh、Ru、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr等。
许多过渡金属离子不能够形成荧光化合物。应为这些金属离子是顺磁性的激发单线态上的电子容易发生向三线态的体系跨越。所以不易发生荧光。此外过渡金属离子形成的配合物，有许多靠得很近的能级容易发生内部能量转换而使分子失活，不大可能发射荧光。
表3中列出了一些无机阳离子的测定方法。
阴离子的荧光测定涉及的反应有5种类型： 氧化还原络合反应，生成离子对；酶反应；取代反应；
复习思考题
1 解释名词：
振动弛豫 系间跨越 量子产率，荧光猝灭， 自猝灭，重原子效应 内转换：外转换 荧光发射： 磷光发射 激发光谱 发射光谱： Stockes位移 荧光寿命 荧光效率 2 简述荧光光谱的特征
3 荧光光谱灵敏度高于吸收光谱的原因 4 分子结构如何影响荧光发射的 5 同步荧光光谱测量的基本方法及特点
6 比较荧光激发光谱，发射光谱和吸收光谱的异同
7 影响荧光分析的环境因素有那些？如何影响荧光测定的？ 8 荧光分析的定量公式及公式的应用条件
9 简要说明时间分辨荧光分析可以消除背景荧光提高选择性的原理 10解释斯托克位移发生的原因
11 荧光发射光谱的形状与激发波长无关的原因 12 荧光分析仪仪器组成及各个部分的作用 13 荧光分析方法的特点（优点缺点）
14 荧光测定物理条件（灯电流，波长扫描范围，狭缝宽度，光电倍增管的电压）的选择 15 简单介绍两种荧光分析新技术及特点
三 : 荧光光谱分析法的基本原理
根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，具有吸收光子能力的物质在特定波长光（如紫外光）照射下可在瞬间发射出比激发光波长长的荧光，利用物质的荧光光谱进行定性、定量分析的方法称为荧光分析法。［www.61k.com)荧光光谱辐射峰的波长与强度包含许多有关样品物质分子结构与电子状态的信息，但外界因素对其荧光强度结果有一定的影响。
当某些物质受到紫外线照射时，会发射出各种颜色和不同强度的可见光，当紫外线停止照射时，所发射的光线会随即消失，人们将这种光线称为荧光。荧光由一种能发荧光的物质-萤石而得名。荧光的产生主要包括物质分子对光能的选择性吸收、激发和分子的去活化三个过程。
光在通过物质的过程中，由于某些频率的光被吸收而强度减弱，这一现象被称为物质对光的吸收。原子、分子或者离子都具有不连续的、数目有限的量子化能级结构，且只能吸收与两能级之差相同或为整数倍的能量。当所照射的光线和所被测物质的分子具有相同的频率时，入射光才能够该物质的分子所吸收。根据量子学理论，分子所吸收的光线可由此来表示，即
? hc hvE E ??? 0 1 (2-1) 式中 E1——吸光物质的高能级（一般为激发态）； E0——吸光物质的低能级（一般为基态）； h ——普朗克（Plank）常数； v——光的频率； ?——光的波长； c——光在真空中的速度。 由于不同物质的特征能级不同，所以它们所吸收的光的波长和颜色也是有区别的，即它们所吸光能量也是不一样的，每种物质都有其特有的吸光光谱。
荧光时物质在吸收入射光之后所发射的辐射，因此，溶液的荧光强度与该溶液的吸收的入射光强度以及该物质的荧光量子产率有密切关系。荧光强度取决于激发态的初始分布与荧光量子产率的大小。
光电探测器主要是将测量的光信号转化为电信号。目前，荧光光度计所采用的光电探测器主要有光电倍增管（PMT）和电荷耦合器件阵列检测器。
美国安诺实验室研发的手持式水中油测定仪用的方法原理就是紫外荧光分析法，因为石油中芳香烃在紫外光的激发下会产生荧光，通过检测荧光的强弱从而获得石油的含量。
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