一 : 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析

姓名 Z P

学号 0925400072

班级 09

指导老师

方法学验证 级医学检验本科二班 沈 富 兵

二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】 目的 用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。方法 运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果 HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论 ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】 乙肝表面抗原 方法学验证 标准曲线 精密度 ELLISA

病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。

1.1.2 仪器及酶标板

酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3 溶液配制

⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 ⑵质控品：

用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。

首先取450μl的8ng/ml的标准品到C1号EP管中再向其中加入150μl的PBS缓冲液，即配制成了6ng/ml的质控品，再取300μl C1号EP管内的溶液到C2号EP管内，再向C2号管内加入300μl的缓冲液混匀。即配制成了3ng/ml的质控品。接着取300μl C2号管内的液体到C3号EP管内，再加入300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。具体方法如下图1

图1

1.2 检测方法

1.2.1 标准曲线各浓度的配制 ⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。 ⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。 ⑶取400μl标准品于标记为?的EP管中，再取200μl?号管内液体于?号管内再向?号管中加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml的标准品。 ⑷再从?号管内取200μl的液体到?号管内，接着取200μl的缓冲液到?号管内混匀，即配制成了2ng/ml的标准品。 ⑸从?号管内取200μl的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml的标准品。 ⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl、200μl、400μl备用。具体方法如下图2

图2

1.2.2 测定方法

⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系列

标准品、质控品及空白对照；

图3

注：双线框区域为标准品,浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三线框区域为质控品，浓度依次为6、3、1.5ng/ml，粗框区域为空白对照加入的是PBS缓冲液，每个孔内加入的均是50μl。

⑵37℃温育30min，洗板4次；

⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔； ⑷37℃温育30min，洗板4次；

⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃温育15分钟； ⑹加入终止液，50μl/孔。 1.3 标准曲线制作及结果计算

⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；

⑵在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件；

⑶选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；

⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。 1.4 统计学方法

用Microsoft Excel处理实验数据。

2 结果

2.1 测得的OD值如下表

二 : 1个有争议的话题：乙肝表面抗原定量的意义

1个有争议的话题：乙肝表面抗原定量的意义

第二军医大学附属长征医院　赵克开、缪晓辉 　　在最新一期美国肝脏病学杂志（Hepatology）上刊登了罗伯特·派里罗（Robert P.Perrillo）撰写的述评，现全文编译，供读者参考。 　　在乙肝治疗中，HBsAg的清除是可望成为最接近于临床治愈的指标。这一结论来自于乙肝自然史，即那些清除了HBsAg的肝硬化患者，存活期更长、肝脏失代偿率更低、肝细胞癌发生率减少。实时定量PCR等分子生物学手段表明，清除了HBsAg患者，其共价闭合环状DNA含量极低（0.002拷贝/肝细胞）。由此也可解释抗-HBc阳性而HBsAg阴性的恶性肿瘤患者在接受化疗时乙型肝炎再激活发生率低的原因。 　　尽管HBsAg清除的临床意义越来越重要，但因其发生率低，故在治疗试验中尚未被视为主要终点。众多研究显示，即使延长核苷类似物的疗程，HBsAg清除率仍与自然清除率相似（年自然清除率在西方HBV携带者为1%～2%，亚洲携带者为0.5%～1%）。虽然干扰素治疗可能清除HBsAg，但在治疗结束后6～十二个月评估结果显示仅在少部分患者能获得此效果。据报道在HBeAg阳性患者干扰素治疗后HBsAg消失率为3%～10%，与疗程长短无明确关联，而在HBeAg阴性患者，HBsAg消失率更低，这类患者持久病毒学应答率（SVR）通常也低。Marcellin及其同事近期报道，在一项聚乙二醇干扰素α-2a单用或联合拉米夫定治疗48周的大型队列研究中，HBsAg的消失率为3%。令人鼓舞的是，无论是HBeAg阳性或阴性，获得SVR后HBsAg清除比例随着随访时间的延长而增加。Marcellin等的研究显示，达到初始应答的患者，干扰素治疗结束后4年的HBsAg清除率达11%。 　　理论上，治疗过程中HBsAg水平下降的程度可为预测SVR或最终清除HBsAg的概率提供有价值的信息，HBsAg水平检测尤其适合于HBeAg阴性肝炎患者的疗效观察。最近有数个商业化HBsAg浓度定量检测系统（Roche公司的ElecsysII，Abbott公司的Architect，Bayer的ADVIA Centaur HBsAgassay，Biomerieux公司的HepanostikaHBsAg）问世，使得阐述此类问题成为可能。这些检测系统在欧洲已得到广泛应用，从而有可能对干扰素和核苷类似物治疗过程中HBsAg的动力学进行比较。使用这些检测系统以及更为繁琐的稀释免疫测定法进行的小规模临床试验显示，与核苷类似物治疗相比，干扰素治疗时血清HBsAg的下降更为迅速。干扰素治疗后12～24周，HBsAg即明显下降，HBsAg浓度的显著变化似仅见于有病毒学应答者。 　　在美国肝脏病学杂志（Hepatology）2009年第4期，有2篇论文深入地探讨了聚乙二醇干扰素治疗HBeAg阴性肝炎过程中检测HBsAg浓度价值。他们均采用雅培公司的Architect法定量检测HBsAg。在Moucari及其同事的研究中，48例患者接受了聚乙二醇干扰素α-2a治疗，发现在治疗早期的HBsAg下降可以很好地预测SVR（定义为治疗1年时PCR法检测HBV-DNA降至不可测水平）。值得注意的是，在整个疗程中，持久应答者和复发者HBV-DNA的下降动力学几乎一致，但HBsAg的下降则有明显差异，提示检测HBsAg浓度预测SVR更为可靠。作者将治疗12周和24周HBsAg下降水平的cut-off值分别确定为0.5log10和1log10IU/ml，其对SVR的阴性预测值分别为92%和97%。以上数据表明，在这些治疗时点如患者HBsAg浓度没有变化或仅有微小的变化，如继续治疗仅有很小的机会获得SVR。在Brunetto等进行的第二项研究中，根据治疗结束时HBsAg的浓度，对386例HBeAg阴性患者治疗后3年的结局进行评价。127例患者单用聚乙二醇干扰素α-2a单一治疗、122例单用拉米夫定治疗，以及137例联合聚乙二醇干扰素α-2a和拉米夫定治疗。结果，治疗结束时HBsAg的水平与治疗六个月时HBV-DNA降至≤400拷贝/ml呈显著相关。而且，HBsAg水平<10IU/ml及治疗48周时下降>1log10IU/ml与治疗后3年HBsAg的清除呈显著正相关。还注意到，与拉米夫定治疗相比，聚乙二醇干扰素治疗（单用或联用）时HBsAg的下降超过30倍，这有可能与干扰素的免疫调节活性有关。 　　根据以上研究数据，如果把HBsAg浓度检测作为HBV-DNA检测的一项重要补充，我们可以设想以下情况：首先，如治疗12～24周时HBsAg浓度的下降未达到某个特定值或许可以作为停止治疗的标准，这样可以减少因继续干扰素治疗而带来的不良反应，并转换为核苷类似物治疗，从长期抑制病毒中获益更多。其次，如果HBsAg的下降达到预设的水平，则可能有助于支持完成48周疗程的必要性。再次，如某些患者HBsAg浓度呈缓慢但稳步的下降，则治疗过程中的HBsAg浓度监测有助于决定是否要将疗程延长超过48周。简言之，监测HBsAg浓度的变化有可能引发1种类似于丙型肝炎治疗的、“应答导向”（response-directed）治疗模式。此外，治疗终点时HBsAg的大幅下降可能有助于预测长期治疗应答。 　　Moucari等和Brunetto等的文章还预示了未来临床研究方向。未来聚乙二醇干扰素的大规模试验应当将HBsAg的定量纳入评价体系，如此，HBsAg下降程度以及评估其下降的最佳间期将更好地被理解和得到验证，从而尽可能准确地预测SVR及HBsAg清除。核苷类似物治疗后HBsAg清除率一般很低，但最近有报道在替诺福韦治疗1～2年后在某些亚组患者的HBsAg清除率达到6%。因此，更新的、更强效的核苷类似物治疗过程中进行HBsAg定量检测，同样有助于对间接评估这些药物对肝脏共价闭合环状DNA的潜在影响。 　　需要指出，无论是HBeAg阳性还是HBeAg阴性肝炎，均发现HBV基因型与干扰素治疗的SVR明显相关。一项综合资料分析（pooleddataanalysis）对超过1200例干扰素治疗的患者进行研究发现，SVR更多见于A基因型的HBeAg阳性病例和C基因型HBeAg阴性病例。D基因型HBeAg阴性患者的SVR率最低。有意思的是，在Brunetto及其同事的这项研究中，该组患者HBsAg浓度的下降最不明显。因此，在解释不同研究之间抗病毒应答的数量和质量的差异时，可能需要将病毒基因型考虑在内。 　　不可否认的是，过去5年，是乙型肝炎治疗大跨步前进的5年。不过，将新的HBsAg定量检测方法及创新的治疗策略联合运用，不仅有可能使我们向“应答导向”治疗靠近，而且有可能使更多的病例获得更完全的或“金牌”应答即HBsAg的清除。 专家点评 南京军医上海临床肝病中心　陈成伟 　　HBsAg转阴无疑是慢性乙型肝炎治疗的1个最理想的替代终点标志，但毕竟是1个替代标志，当前并无循证证据表明，在抗病毒治疗中发生率与自然阴转率有显著差异。 　　HBsAg定量检测正“不遗余力”地在国内推广，是否每个乙肝患者在每个时段都必须监测这一项目？本文提供了1个很好的参考答案。 　　干扰素治疗12～24周，HBsAg下降如未达一特定值，或许可作为改用核苷类药物的1个指标；如达一特定值，则有助于支持完成48周疗程的必要性，如治疗过程中HBsAg稳定下降，有助于决定疗程延长至48周。

三 : 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析

姓名 Z P

学号 0925400072

班级 09

指导老师

方法学验证 级医学检验本科二班 沈 富 兵

二〇一三年四月

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

乙肝表面抗原定量测定的方法学验证 作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）

【摘要】 目的 用福州蓝图生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒对乙肝表面抗原定量测定的方法进行验证，以判断是否能用于教学以及临床分析。［www.61k.com]方法 运用ELLISA法定量测定乙肝表面抗原，应用试剂盒HBsAg标准从浓度为8ng/ml的2倍稀释的6个浓度梯度，根据OD值绘制标准曲线再计算相对回收率和板内和板间精密度，通过资料数据综合分析。结果 HBsAg线性较好，其准确度、精密度、LOD值均在正常范内。结论 ELISA法定量检测HBsAg能较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况，可以用于教学以及临床分析。

【关键词】 乙肝表面抗原 方法学验证 标准曲线 精密度 ELLISA

病毒性肝炎中乙型肝炎的危害较大，我国是病毒性乙型肝炎的高发流行区，普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率接近60％，约占世界HBV携带者的1/3。乙型肝炎病毒的病原体不仅具有传染性，还可能导致发展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。酶免分析法HBV—EIA是HBV抗原和抗体最常用的检测技术，其方法简便、价廉，适合一般实验室推广，其中酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)目前应用最为广泛，它常用聚苯乙烯为固相载体，使其与待测标本中的相应抗体或抗原结合，然后加酶标记的抗原或抗体，再加底物显色，最后根据色泽深浅来推算待测抗原或抗体的含量。此方法特异性高，有效测定范围可达到20500 ng/ml，且酶免疫法有标记的试剂比较稳定并且无放射线危害等优点。

我们采用对已知抗体浓度的样品进行ELISA的定量检测，通过对其数据的分析来验证ELISA法最乙肝表面抗原定量检测的准确性和可靠性，以衡量其实用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。

1.1.2 仪器及酶标板

酶标仪：Bio-Rad 680；洗板机：Bio-Rad 1575；超纯水系统：Millipore Elix；电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。

1.1.3 溶液配制

⑴0.01M pH7.4的PBS缓冲液：

称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4, 溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 ⑵质控品：

用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

首先取450μl的8ng/ml的标准品到C1号EP管中再向其中加入150μl的PBS缓冲液，即配制成了6ng/ml的质控品，再取300μl C1号EP管内的溶液到C2号EP管内，再向C2号管内加入300μl的缓冲液混匀。[www.61k.com]即配制成了3ng/ml的质控品。接着取300μl C2号管内的液体到C3号EP管内，再加入300μl的缓冲液混匀，即配制成了1.5ng/ml的质控品。具体方法如下图1

图1

1.2 检测方法

1.2.1 标准曲线各浓度的配制 ⑴用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。 ⑵先取6个EP管分别标记为对应的浓度。 ⑶取400μl标准品于标记为?的EP管中，再取200μl?号管内液体于?号管内再向?号管中加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了浓度为4ng/ml的标准品。 ⑷再从?号管内取200μl的液体到?号管内，接着取200μl的缓冲液到?号管内混匀，即配制成了2ng/ml的标准品。 ⑸从?号管内取200μl的标准品到④号管内，再向④号管内加入200μl的缓冲液混匀，即配制成了1ng/ml的标准品。 ⑹用同样的方法，配制好浓度分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml.的标准品体积分别为200μl、200μl、400μl备用。具体方法如下图2

图2

1.2.2 测定方法

⑴取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中加入已配制好的系列

标准品、质控品及空白对照；

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

图3

注：双线框区域为标准品,浓度依次为8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三线框区域为质控品，浓度依次为6、3、1.5ng/ml，粗框区域为空白对照加入的是PBS缓冲液，每个孔内加入的均是50μl。［www.61k.com］

⑵37℃温育30min，洗板4次；

⑶加入酶标抗体，生物素二抗，50μl/孔； ⑷37℃温育30min，洗板4次；

⑸加入A、B液，50μl/孔，37℃温育15分钟； ⑹加入终止液，50μl/孔。 1.3 标准曲线制作及结果计算

⑴酶标板放入酶标仪，盖上盖子；

⑵在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件；

⑶选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值；

⑷输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。 1.4 统计学方法

用Microsoft Excel处理实验数据。

2 结果

2.1 测得的OD值如下表

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乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

图4

注：图4与图3相对应

2.2 标准曲线

图5

由上图可得出如下结论：

标准曲线以浓度为横坐标，以测得的OD值为纵坐标。（www.61k.com］由对应浓度和OD值得出的散点连成一条直线后，散点基本都在直线上，说明散点的线性非常好。在以后检测乙肝表面抗原浓度的时候可以根据测出的OD值在标准曲线上找出对应的浓度。

2.3 准确度（回收率）计算

各质控品高中低三个浓度平均回收率分别为92.59%、100.887%、93.68% 都在正常范围内 如表1所示。

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

ELISA法检测VEGFR2-Fc的回收率

准确度（回收率）计算VEGFR2-Fc (ng/ml)

6 6 6 6 6 3 3 3 3 3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

测定值(ng/ml)

回收率(%)

平均回收率RR(%) 92.59

SD(%)

4.998 5.637 5.642 5.715 5.787 3.093 3.005 2.918 3.005 3.112 1.377 1.450 1.377 1.421 1.401 83.3 93.95 94.033 95.25 96.45 103.1 100.167 97.267 100.167 103.733 91.8 96.667 91.8 94.733 93.4 表1

5.30

100.887 2.60

93.68 2.07

2.4 精密度计算

2.4.1 板内精密度

板内精密度质控品各浓度组的RSD都小于15%，精密度良好，如表2所示。(www.61k.com］

板内精密度

VEGFR2-Fc 测定值 测定值 （ng/ml）

测定值

测定值 测定值

1 2 3

5.642 2.918 1.377

4

5.715 3.005 1.421 表2

5

5.787 3.112 1.401

S?

5.694±0.318 3.027±0.078 1.405±0.031

RSD(%)

63 1.5

4.998 3.093 1.377

5.637 3.005 1.450

5.5852.577 2.210

2.4.2 板间精密度

板间各组浓度质控品RSD都小于15%，说明板间精密度达到标准。如表3所示。

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

板间精密度

VEGFR2-Fc 测定值 测定值 测定值 测定值

（ng/ml）

6

6 6 3 3 3 1.5 1.5 1.5

4.998 5.471 5.773 3.093 2.815 2.886 1.377 1.226 1.665

5.637 5.423 5.674 3.005 3.335 3.344 1.450 1.257 1.243

5.642 5.674 5.782 2.918 3.187 3.118 1.377 1.227 1.236

5.715 5.323 5.547 3.005 3.221 3.234 1.421 1.564 1.541 表3

测定值 5.787 5.746 5.667 3.112 2.933 2.997 1.401 1.334 1.320

S?5.694±0.318 5.5274±0.177 5.689±0.096 3.027±0.078 3.098±0.216 3.116±0.182 1.405±0.031 1.322±0.142 1.401±0.192

RSD(%) 5.585 3.202 1.687 2.577 6.972 5.841 2.210 10.741 13.704

2.5 检测限（LOD）计算：

取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。（www.61k.com) 空白孔的OD值的均数=0.0098 空白孔的OD值的标准差=0.0028 LOD=0.0098+2*0.0028=0.0154

3 讨论

通过图4、图5和表1、表2、表3可知本次实验的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值都复合实际，且各数据都趋于理想，对此我们做出分析： HBsAg是乙肝病毒感染后最早出现的血清标志物之一，因此HBsAg的检测是诊断肝炎病毒感染的重要依据。而针对这项检测的检测方法的灵敏度与高特异性的高低以及二者的结合程度是影响检验结果的重要因素，直接关系到临床诊断和用药，所以对HBsAg的检测方法的建立和方法的验证是实验成败的关键所在。

本实验以HBsAg测定为例，为了对乙肝表面抗原ELISA法定量进行分析的方法学建立与验证，以确认ELISA法定量检测HBsAg能否较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况。按试剂说明书严格操作的同时做标准曲线。本实验用的试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相关。［www.61k.com)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。本实验严格按试剂说明书操作的同时运用计算机软件和酶标仪，测得了OD值且绘制出了标准曲线。

本实验采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），通过倍比稀释来完成其定量检测。其中，标准品的浓度依次为：8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每个浓度设置两个孔，共十二个孔；质控品的浓度依次为:6、3、1.5ng/ml，每个浓度设置五个孔，共十五个孔。往标准品、质控品依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，而阴性对照加入等量PBS,经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算质控品的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值。

本实验是设计精密，操作简便、快捷。主要是通过对质控品的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值的计算和根据标准品的OD值得出的标准曲线，以确认ELISA法定量检测HBsAg能否较准确、快速地反映体内乙肝病毒复制情况。

如图5所示，标准曲线相关系数为0.9985，接近于1，即相关性良好。方法准确度(accuracy)，一般用相对回收率表示，表明用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度，由表1可得出相对回收率符合参考值85%～115%，所以该测定方法比较准确。

方法精密度(precision)，一般用RSD表示，对于ng／ml级水平的RSD一般应≤15％。由表2板内精密度和表3板间精密度可知，板内精密度完全符合要求，板间精密度基本符合要求。

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检测限LOD，又称方法的灵敏度，由计算得LOD=0.0154，说明本分析方法对于低浓度样品的检测灵敏度高。

根据流行病学调查, 我国人群乙型病毒肝炎感染率达10% 左右,乙肝的实验诊断对于其治疗及预防有重要参考意义。ELLISA适用于乙肝表面抗原的定量测定, 其优点是快速、方便、操作简单, 且灵敏度相对于其他方法较高, 自20世纪70年代以来, 许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测, 特别是酶联免疫法( ELLISA法)应用最广，其解决了低浓度HBsAg的定量检测问题, 能够及时

乙肝表面抗原定量 乙肝表面抗原定量测定的方法学验证

有效的测定出乙肝表面抗原含量，对临床诊断和用药提供有力的依据。[www.61k.com)

综上所述，通过实验对HBsAg的准确度、板内精密度、板间精密度、LOD值的评价和分析，证实该定量检测方法，具有高灵敏度和高特异性，能够满足临床检测和教学的要求。

参考文献

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本文标题：乙肝表面抗原定量-乙肝表面抗原定量测定的方法学验证
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