一 : 大肠杆菌蛋白表达

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达?

吴雪琼张俊仙郑越张灵霞

中国人民解放军第三0九医院结核病研究室(北京 100091)

【摘要】目的通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS-PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果重组质粒pET24b-Ag85B测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30%左右。纯化后的rAg85B样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右，每100 ml培养菌可获得10 mg左右纯化的重组蛋白。结论pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。

【关键词】蛋白 Ag85B基因表达克隆分支杆菌，结核

结核病是世界上主要的传染病之一，其致病菌结核分支杆菌分泌许多蛋白到细胞外，它们在结核患者的免疫反应中起重要作用。十几年来国内外学者一直从结核分支杆菌培养滤液中提纯蛋白质抗原进行多方面的研究，由于该方法制备蛋白抗原较烦琐、费时，因此，近年来许多研究者应用大肠杆菌来表达结核分支杆菌基因，简便地获得了大量结核分支杆菌单一的蛋白抗原。Ag85复合物是结核分支杆菌和BCG主要的分泌性蛋白，在结核分支杆菌H37Rv株中占分泌蛋白总量的30%，可从早期培养物中分离，是一种极不稳定的蛋白，经SDS-PAGE和等电聚焦分析可分为3个组分Ag85A，Ag85B和Ag85C，分别为31 kDa，30 kDa和31?5 kDa的蛋白质，结核分支杆菌以2∶３∶1的比例将它们三者分泌于培养液中。由于Ag85B是结核分支杆菌主要的保护性抗原，1996年Harth等［1］首次克隆、测序了结核分支杆菌Ag85B蛋白的编码基因，并表达了该蛋白。因此，本文通过结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达，大量纯化rAg85B蛋白抗原，为进一步研究其免疫学特性，研制更有效的结核病免疫诊断试剂和新型的结核病疫苗奠定了基础。

1材料与方法

1?1材料

1?1?1菌株和质粒来源表达载体质粒pET-24b购自Novagen公司，宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)为北京农业大学李大伟博士惠赠；结核分支杆菌H37Rv株为本研究室保存株。

1?1?2工具酶限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ及T4 DNA连接酶系Promega公司产品；Taq plusⅡ DNA聚合酶购自上海申工生物工程公司。

1?1?3试剂DNA快速纯化试剂盒购自北京华美生物工程公司；蛋白质中等分子量标准为Sigma公司产品。

1?1?4引物合成由北京奥科生物工程公司合成扩增Ag85B基因的上、下游引物。

1?2方法

1?2?1Ag85B基因片段的扩增在100?l反应体系中，4种dNTP的终浓度为0?2 mmol/L，引物1，2的终浓度各为0?4?mol/L，纯化的DNA模板50 ng，Taq plusⅡ DNA聚合酶3 U。置DNA热循环仪扩增后，在0?8%琼脂糖凝胶中电泳检测992 bp的扩增片段。

1?2?2Ag85B基因片段和载体质粒DNA的酶切及回收以限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ分别对Ag85B基因片段和质粒pET-24b DNA进行双酶切。在40?l反应体系中，含DNA 1?5?g左右，NheⅠ 20 U，10×反应缓冲液4?l，牛血清白蛋白(10?g/ml)0?4?l，于 37?℃水浴反应2 h后，加HindⅢ 20 U，于 37?℃水浴继续孵育2～3 h，在0?8%琼脂糖凝胶中电泳分析酶切结果，并用DNA快速纯化试剂盒回收。

1?2?3DNA重组、转化与鉴定参照文献［2］介绍的方法，将酶切的Ag85B基因片段和质粒pET-24b DNA片段通过T4 DNA连接酶在 14?℃连接过夜后，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性重组子，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定。

1?2?4DNA序列分析pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌中目的基因序列的测定由北京奥科生物工程公司完成。

1?2?5Ag85B基因的诱导表达将pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌接种于含卡那霉素50?g/ml的LB液体培养基中，37?℃培养至A600=0?6～0?8 h，诱导表达3～4 h收集菌体。

1?2?6SDS-PAGESDS-PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平。将菌体悬浮于适量的1×SDS凝胶载样缓冲液中，置沸水浴中5～10 min，离心后取上清，加于4?5%浓缩胶和12%分离胶中进行SDS-PAGE电泳。凝胶经考马斯亮蓝G-250染色和甲醇/冰乙酸脱色后，观察结果并照相保存。

1?2?7菌体破碎和包涵体提取诱导后的pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌按文献［2］介绍的方法提取包涵体，取部分上清液和包涵体沉淀进行SDS-PAGE分析，以确定Ag85B在大肠杆菌中的表达形式。

1?2?8重组蛋白的回收、纯化及含量测定采用Novagen公司生产的His.Blnd蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白，按试剂盒说明书介绍的操作步骤进行。通过Lowry法［3］测定蛋白含量，除菌过滤后置-20?℃贮存备用。

2结果

2?1pET24b-Ag85B重组质粒的酶切鉴定构建表达株的策略是将Ag85B编码基因插入表达载体pET24b的限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ位点，质粒pET24b含5?310 bp，Ag85B编码基因含978 bp，而pET24b-Ag85B重组质粒中只含一个NheⅠ和HindⅢ酶切位点，因此，经这两个酶同时酶切后产生两条约5?254 bp和981 bp大小的片段。

2?2pET24b-Ag85B重组质粒DNA序列分析分别以T7启动子引物和T7终止子引物测pET24b-Ag85B重组子基因序列，Ag85B基因序列与基因库(EMBL数据库No.U38939)中报道的序列一致。

2?3pET24b-Ag85B重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达pET24b-Ag85B重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导1～4 h后，以SDS-PAGE分析可见明显的特异表达产物带，诱导3～4 h时表达量最多(图1)，分子量约为35 kDa左右。光密度扫描分析表明占菌体总蛋白30%左右。将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分分别进行SDS-PAGE分析，沉淀部分可见较明显的特异蛋白表达带，而上清液中只见极少量特异蛋白表达带，说明表达的rAg85B大多以细胞内不溶性包涵体的形式存在(见图2)。

2?4重组蛋白的纯化应用His.Bind蛋白纯化试剂盒在变性条件下纯化rAg85B蛋白，纯化后的样品经SDS-PAGE分析显示只见一条回收的蛋白带(图2)，未见其他杂带，经光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右。经Lowry法定量后估算，每100 ml培养菌可获得约10 mg的重组蛋白。1，2均为IPTG诱导前； 3～6分别为IPTG诱导后1，2，3，4 h

图1SDS-PAGE鉴定重组Ag85B在大肠杆菌中的表达

1为蛋白质中等分子量标准(205，116，97，84，66，55，45，36，29，24 kDa)；2为rAg85B大肠杆菌IPTG诱导后；3，4为纯化的rAg85B蛋白；5，6分别为rAg85B表达菌超声破碎后的沉淀和上清

图2rAg85B蛋白的SDS-PAGE分析3讨论

本组构建的结核分支杆菌Ag85B大肠杆菌工程菌株，重组质粒酶切图谱与预期结果相符，其Ag85B的DNA序列也完全正确。它以包涵体形式表达，表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。由于表达载体pET24b上携带一个6×组氨酸，它可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析(IMAC)柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合，而使重组蛋白直接纯化，获得单一融合蛋白。本文应用His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白，纯化程序简单，纯化效率较高，蛋白纯度可达95%左右。表达量较高，100 ml培养菌可纯化 10 mg左右的蛋白，纯化 1?000 ml菌的表达蛋白就足够研究应用了。该蛋白的应用研究正在进行之中。

目前的研究表明，Ag85是一组重要的分支杆菌分泌性蛋白，具有分支菌酸转移酶活性，在分支杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥重要的作用；Ag85蛋白或DNA疫苗免疫动物后可诱导特异的细胞和体液免疫应答；此外，活动性结核患者血清中的Ag85B水平比其他分支杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍［4］，而重组的Ag85B蛋白和自然分泌蛋白的免疫学特性和生物学功能无明显差别。因此，Ag85B蛋白的克隆、纯化有助于结核病的免疫学研究，促进结核病预防、治疗和诊断新制剂的发展。

二 : 蛋白表达系统：蛋白表达系统-蛋白表达定义，蛋白表达系统-蛋白表达系统

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -蛋白表达定义

（www.61k.com]蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的1种分子生物学技术。在基因工程技术中占有核心地位。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -蛋白表达系统概述

蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：

1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。

2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。

3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -蛋白表达系统分类及优劣分析

原核蛋白表达系统既是最常用的表达系统，也是最经济实惠的蛋白表达系统。原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。

酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控。

哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，最容易保留生物活性，缺点是表达量通常较低，稳定细胞系建立技术难度大，生产成本高。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -大肠杆菌表达系统

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体2种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另1个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -酵母表达系统

酵母表达系统作为1种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为1种表达大规模蛋白的强有力的工具。

常用的酵母表达系统：

一，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达系统：

酿酒酵母(Saecharomycescerevisiae)在酿酒业和面包业的使用已有数千年的历史，被认为是GRAS(generally recognized as safe)生物，不产生毒素，已被美国FDA确认为安全性生物，但酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌

二，甲醇营养型酵母表达系统：

甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，并以毕赤酵母属(Pichia)应用最多。

甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。

酵母表达的特点酵母是1种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -昆虫表达系统

昆虫表达系统是1类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同1个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。由于病毒多角体蛋白在病毒总蛋白中的含量非常高，至今已有很多外源基因在此蛋白的强大启动子作用下获得高效表达。。常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有1个多克隆位点和多角体蛋白启动子。

杆状病毒系统的主要有点包括

1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配

2，蛋白翻译后的加工修饰；

3，表达水平高，可达总蛋白量的50%；

4，可容纳大分子的插入片段；

5，能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -哺乳动物表达系统

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。

根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。

哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。

蛋白表达服务_蛋白表达系统 -植物表达系统

植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激紊、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达，然而提取与纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍。Doloressa等据内质网和内质网信号肚在蛋白质合成中的作用，把三种重组蛋白，即嗜热细菌来源的木聚糖酶、水母的绿色荧光蛋白和人胎盘分泌的碱性磷酸酶(SEAP)定位到质外体中，通过根分泌和叶分泌途径获得表达，从而建立了2种新的重组蛋白表达系统——植物根分泌和叶分泌，简化了分离和纯化程序，为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供了潜在的途径。虽然利用植物表达、生产外源性蛋白起步较晚，但目前已经能够利用植物生产多种医用、食用以及工业用蛋白及酶制剂。

总之，各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低；但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐。因此，选择表达系统时，应充分考虑各种因素，如要表达蛋白的性质、生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。随着对外源基因表达系统研究的不断深入，随着更多表达机理和影响因素的发现，相信在不久的将来，原核与真核2种表达系统在重组蛋白的生产研究中仍然都会占有一席之地，并将出现更多更加完善的表达系统。

蛋白表达

三 : 大肠杆菌表达系统-蛋白表达服务|金开瑞生物工程

蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。[www.61k.com］蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中的表达。宿主，表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。载体，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。载体的种类与宿主相匹配，根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。
蛋白表达服务平台提供：大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统是最常用，最经济实惠的蛋白表达体系，具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。目前已知的大肠杆菌表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两类。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白或多肽片段的DNA序列融合在菌体内表达。融合表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。
金开瑞拥有的大肠杆菌表达系统常用的宿主有：BL21(DE3)、BL21(DE3) plys、Rosetta(DE3)、Rosetta-gami 2(DE3)、Rosetta-gami 2(DE3)plys、ArcticExpress (DE3)、Origami(DE3)、C41(DE3)OverExpress、BL21-GOLD(DE3)。
一些蛋白表达出来后会对宿主菌有毒害，导致菌体无法正常生长，蛋白无法制备；一些宿主可以耐受毒性蛋白，如C41。通过严格调控宿主表达，在诱导前，外源蛋白泄漏表达得到有效控制，菌体能正常生长，到一定的密度后再诱导，毒性蛋白在短时间内迅速积累，如BL21（DE3）pLysS。一些基因含有大肠杆菌不常用的密码子，导致蛋白翻译效率降低，使用带有稀有密码子tRNA的宿主，可有效翻译稀有密码子。如Rosetta系列，该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。外源蛋白在大肠杆菌内表达经常由于不能正确折叠而形成包涵体，分子伴侣能在细胞内帮助蛋白折叠，避免形成包涵体。如Rosetta-gami2(DE3)含有ahpC galE galK rpsL等分子伴侣。
大肠杆菌表达系统常用质粒：
最常用的pET表达系列含（His，GST，Trx，共表达，分泌表达，包涵体表达等做种表达形式的载体）
pGEX系列（GST融合表达，助溶+纯化）
pCold（低温启动子，提高可溶表达，菌体自身蛋白少）
Sumo融合表达（助溶，可完全切除标签）
BMP融合表达系统（助溶+纯化）
标签组合如：His+sumo，His+GST
金开瑞大肠杆菌蛋白表达系统服务特色：
1、His、GST、MBP等标签多种表达方式同时进行，确保获得最优质的蛋白；
2、保证蛋白为普通缓冲可溶；
3、纯化的蛋白经过ELISA，Western-blot，或者其它生物活性验证；
4、可提供详细的表达纯化条件，实验数据以及菌株。

大肠杆菌表达系统服务周期及报价

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