一 : 微生物菌种保藏方法
1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、
培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的
浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大
多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物
质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种
方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方
法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌
等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如
①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在
室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)
置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养
至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。 ②砂土保存法：取清洁的砂，筛去掉大砂
粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入
1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进
行菌种保藏。 ③硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。
④磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃
棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两
年半时间。 ⑤麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。 ⑥纸片(滤纸)保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。
4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有， ①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。 ②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点， ①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞; ②要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异; ③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长; ④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等); ⑤可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。 ⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。 ⑦就动物细胞而言，应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻; ⑧若进行长期保存，则贮藏温度越低越好; ⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。 常用的冷冻保存法包括：
①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，
有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。 ②干冰保存法(-70℃左右)：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。 ③液氮保存法(-196℃)：是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下， a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中，将0.2～1ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。 b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中(-150℃～-170℃)时，则不需熔封。 c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色素进入安瓶。 d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱内缓慢冷却30～60min。 e、速冷：最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。
7、冷冻干燥保存法：其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此
可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：
a、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若
为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/ml。 b、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。 c、安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。 d、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、甘油管保藏法：在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于-20℃冰箱中保存。
二 : 90微生物菌种的保藏方法
第３３卷第４期２０１０年４月Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．４Ａｐｒ．２０１０
微生物菌种的保藏方法
付美红，王耀耀,朱研研,郝慧云,刘云清,王亚莉
（华北制药集团新药研发中心，河北
[摘
石家庄
０５００１５）
要]菌种的保藏方法有很多，其原理主要是根据微生物的生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧条件，抑制微生物
的代谢作用，使其生命活动降至最低程度或处于休眠状态，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的。
[关键词]微生物菌种；保藏方法[中图分类号]Ｑ９３－３３６
[文献标识码]Ａ
[文章编号]１００３－５０９５（２０１０）
０４－００３３－０２
在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得
十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素。所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这３个因素设计的。
1斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，当菌体长满斜面后，棉塞部分用油纸包扎好或把试管的棉塞换成无菌橡皮塞并用蜡烛封好后置于０～４℃的冰箱中保藏。但要注意菌种的保藏时间及温度因微生物的种类不同而不同，如霉菌、放线菌等保藏２～４个月需移种１次，细菌最好每月移种１次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多［１］。2液体石蜡保藏法
此法亦称矿物油保藏法。先将化学纯石蜡油装于三角瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包裹，高压灭菌，然后将其置于恒温箱中，让水分蒸发至完全透明后备用。
[收稿日期]２０１０－０１－２２
[作者简介]付美红（１９８１－），女，助理工程师，主要从事微生
保藏工作。物菌种选育、
在无菌条件下，用吸管将石蜡油注入已长好的斜面试
管中，用量以高出斜面顶端１ｃｍ为宜，使菌种与空气隔绝，然后在棉塞外包上塑料纸或牛皮纸，将试管直立置于０～４℃的冰箱中保藏或低温干燥处保藏。保藏期间应定期检查，若培养基露出液面，应及时补充无菌石蜡油，使培养基始终处于液面下［２］。
此法实用且效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏两年以上不死，酵母菌可保藏１～２年，一般无芽孢细菌也可保藏１年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在３７℃温箱内亦可保藏３个月之久。此法的优点是制作简单、不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅［３］，应特别注意。3滤纸保藏法
将滤纸剪成小条，装入安瓿管中，塞以棉塞，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使其充分生长。灭菌脱脂牛乳１～２ｍＬ滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽干。将棉花塞入管内，用火焰熔封，低温保存。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏两年左右，有些丝状真菌甚至可保藏１４～１７年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。
4沙土保藏法
·３４·河北化工第４期
取河沙过４０目筛去粗粒后，用１０％盐酸浸泡２～４ｈ以除去有机质，倒去酸水后用自来水冲洗至中性，烘干备用。另取非耕作层的不含腐殖质的瘦黄土或红土，用自来水浸泡使其呈中性，然后烘干、碾碎过１００目筛。将处理好的沙与土以（２～４）∶１的比例混匀，分装于小试管内，每管装１ｇ左右，塞上棉塞，用牛皮纸包好后高压灭菌。然后将培养成熟的优良菌种（一般指孢子层生长丰满的菌种）用无菌水洗，制成孢子悬液，每支沙土管用无菌吸管加入悬液０．５ｍＬ（一般以使沙土刚刚润湿为宜），塞好棉塞放入盛有干燥剂的真空干燥器内，用真空泵抽干水分。抽真空时间越短越好，以免孢子萌发。抽干的沙土管用无菌勺子捣松并每个种抽取１支回接于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长。若经检查没有问题，则将制备好的沙土管用石蜡封口放入冰箱或室内干燥处保藏［４］。
此法多用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广、效果亦好，可保存两年左右，但应用于营养细胞效果不佳［５］。5液氮冷冻保藏法
先将菌种制成悬液备用，然后清洗安瓿瓶并烘干，再往安瓿瓶中注入冷冻保护剂。保护剂应根据被保藏微生物的类别选择，一般每瓶注入１０％～２０％的甘油０．８ｍＬ，塞上棉塞，高压灭菌，检查无菌后接入菌种，火焰熔封瓶口。将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，冷冻速度以１ｍｉｎ下降１℃为好，使其冻结。然后将冻好的安瓿瓶立即放入液氮罐中保藏。恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入３８±２℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿瓶，将内容物移入适宜的培养基上培养。
此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物，如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。6冷冻干燥保藏法
将安瓿瓶用２％的盐酸浸泡１０～１２ｈ，用自来水冲洗干净后再用蒸馏水浸泡至ｐＨ值呈中性，干燥后
高压灭菌。将已生长好的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶及海藻糖等保护剂中制成浓菌液，将菌液无菌操作分装于准备好的安瓿瓶中。分装好的安瓿瓶放入低温冰箱中冷冻，然后将冷冻后的安瓿瓶置于冷冻干燥箱内，冷冻干燥８～２０ｈ后用真空泵抽真空，并在真空状态下熔封安瓿瓶，在－２０℃下保藏［６］。
此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。该方法保藏的微生物菌株有分发时不用事先开启，便于包装，降低在运输过程中泄漏的危险等优点，但操作复杂、设备昂贵。
7结语
除上述方法外，还有蒸馏水保藏法、生理盐水保藏法、自然基质保藏法等，以上各法可根据实验室具体条件与需要及菌种特性选用。菌种是一种重要的生物资源。菌种的保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌种，而且也是研究、推广、开发和
随着生物学技术的不断发实际应用科研成果的基础。
展，种质资源的利用对生命科学的研究起着越来越重要的作用，对菌种保藏技术也提出了越来越高的要求［７］。掌握先进的菌种保藏技术，为菌种的科学研究和工业生产提供有力的技术支持，正是菌种保藏的意义所在。
[参考文献]
［１］霍红．蜜环菌菌种保藏技术要点［Ｊ］．食用菌，２００３，（６）：４２．［２］吴建忠．食用菌母种保藏技术［Ｊ］．科学种养，２００８，（３）：２４．［３］李雁．微生物简易保藏方法及其应用［Ｊ］．湖北畜牧兽医，１９９８，（３）：２０－２２．
［４］黄日明．食用菌育种栽培加工技术［Ｍ］．湖南：湖南科学技术出版社，１９９８．
［５］吕线红，郭利美．工业微生物菌种的保藏方法［Ｊ］．山东轻工业学院学报，２００７，２１（１）：５２－５５．
［６］武治昌．食用菌菌种保藏技术［Ｊ］．农村科技开发，２００４，（８）：２９－３０．［７］蔡令仪，谭琦，曹晖，等．不同菌种保藏方法对香菇产量的影响［Ｊ］．食用菌学报，２００３，１０（１）：５２－５４．
三 : 微生物菌种保藏方法
1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、
培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的
浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大
多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物
质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种
方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方
法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌
等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如
①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在
室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)
置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养
至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。 ②砂土保存法：取清洁的砂，筛去掉大砂
粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入
1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂(经HCl预处理)和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进
行菌种保藏。 ③硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。
④磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠(或多孔玻璃珠)后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶(或无水CaSO4)，上铺玻璃
棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，最后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两
年半时间。 ⑤麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，最后干燥保藏。 ⑥纸片(滤纸)保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。
4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有， ①蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。 ②糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点， ①要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞; ②要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异; ③要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长; ④最好在菌液内不添加电解质(如食盐等); ⑤可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。 ⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。 ⑦就动物细胞而言，应在-20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度;而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在-35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻; ⑧若进行长期保存，则贮藏温度越低越好; ⑨取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。 常用的冷冻保存法包括：
①低温冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，
有些可添加保护剂。此外，也可用φ5mm的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。 ②干冰保存法(-70℃左右)：即将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。 ③液氮保存法(-196℃)：是适用范围最广的微生物保存法。其操作步骤如下， a、装安瓶管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂(保存霉菌不用防冻剂)的灭菌溶液中，将0.2～1ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。 b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中(-150℃～-170℃)时，则不需熔封。 c、检查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡2～30分钟后，观察有无色素进入安瓶。 d、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约1℃/min的速度冷却至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱内缓慢冷却30～60min。 e、速冷：最后浸入液氮中快速冷却至-196℃。
7、冷冻干燥保存法：其原理是首先将微生物冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此
可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种(包括噬菌体和立克次氏体等)的保存。在进行冷冻干燥时，需注意以下几个问题：
a、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜;菌龄以达到对数生长期为好;若
为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好;菌液浓度以高为好，如细菌应达到109～1010/ml。 b、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。 c、安瓶的准备：将安瓶在2%HCl中浸泡过夜，自来水冲洗3次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，60℃恒温干燥。 d、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉汤以及加7.5%葡萄糖的血清等等。
8、甘油管保藏法：在5ml菌种保藏管中，将等体积的菌悬液和40%的甘油充分混匀后，于-20℃冰箱中保存。
四 : 如何对微生物菌种进行活化？
如何对微生物菌种进行活化?
能否更具体一些?比如说分为哪些步骤？
如何对微生物菌种进行活化？的参考答案
菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养,逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物,即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物.菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程,因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同,所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境
要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法.目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃ 冰箱冻结法、液氮超低温冻结法.
对于不同的保存方式活化的方式也不同：
1 定期移植法的菌种复苏较简单,直接转接即可；
2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时,挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次；
3 沙土管法保存菌种在复苏时,在无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接一次.或取沙土粒于适宜的液体培养基中,增殖培养后再转接斜面；
4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,将安瓿管顶部烧热,用无菌棉签沾冷水,在顶部擦一圈,顶部出现裂纹,用挫刀或镊子颈部轻叩一下,敲下已开裂的安瓿管的顶端,用无菌水或培养液溶解菌块,使用无菌吸管移入新鲜培养基上,进行适温培养；
5 -80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时,从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动.直到内部结冰全部溶解为止,约需50秒-100秒.开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养
6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏相似,从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动.直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒.开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养.
总结一下菌种活化需要以下几个步骤：
第一配置菌种适宜生长的培养基
第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态,比如将冷冻的菌种解冻
第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养,此步骤称为菌种复壮
第四步挑选培养基茁壮的菌落,挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养,重复此步骤2-3次,从而得到生长良好的菌落
经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的
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微生物菌种保藏中心-微生物菌种保藏方法 本文地址：
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