二代测序-第二代测序技术

发布时间：2018-02-07 所属栏目：mbti第二步测试序列号

一 : 第二代测序技术

第二代高通量测序技术简介
? 四大高通量测序平台
Solexa，454 (GS-FLX)，

SOLiD和Polonator
?

测序原理
合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation)

454 (GS-FLX)
? Roche：（2005，2007，2008） ? 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。

454 (GS-FLX)流程
1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。

454 (GS-FLX)流程
? 2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在 DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化；

454 (GS-FLX)流程
? 3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入 PTP板中供测序反应使用。

454 (GS-FLX)流程
? 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息

Solexa-Illumina Genome Analyzer
? 核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。
? 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计 Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。

SOLiD
? ABI(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) ? 原理：用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。

SOLiD流程
? 1、SOLiD基因组文库的构建

SOLiD流程
? 2、油包水PCR

SOLiD流程
? 3、含DNA模板P1磁珠的固定

SOLiD流程
? 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程

SOLiD流程
? 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程

SOLiD流程
5. 数据分析原理

Polonator
? 测序原理： Polonator系统高质量测序是一种以连接反应进行DNA序列分析的技术，该系统采用结合在磁珠上单分子DNA片段簇为测序模板，以CY5、Texas Red、CY3、6-FAM四色荧光标记的9碱基单链荧光探针混合物进行连续的连接反应为基础，对扩增的DNA片段进行大规模高通量测序。

Polonator流程